Hoechst 33342 和 Rhodamine123 染色分析造血干细胞特征

Hoechst 33342 和 Rhodamine123 染色分析造血干细胞特征是鉴于体外活体染料 Rhodamine123 (Rh123) 和 Hoechst 33342 (Ho) 已经被证实是分析原始造血干细胞 (PHSCs) 的特性，鉴定、分离和纯化的十分有效的探针，将与干细胞密切相关的群体区分开来。目前，分析造血干细胞特征采用方法为 Hoechst 33342 和 Rhodamine123 染色。

Hoechst 33342 和 Rhodamine123 染色分析造血干细胞特征的基本原理是 Rh123、Ho 单独应用或联合应用，能结合干细胞特定表面相关抗原、凝集素或其他体外活体染料一起分析，根据长期移植潜能、细胞周期动态和更新率、进入细胞周期的细胞比率、细胞因子受体库和基因表达模式、对细胞因子偏好、反应性和体外克隆形成能力准确地将小鼠原始造血干细胞按照发育的情况排序，将与干细胞密切相关的群体区分开来。

器材：流式细胞仪、链霉亲和素微珠。

试剂：

①Hoechst 33342 粉：用无菌蒸馏水配制 20 mM 储存液，每管分装 50ul，-20°C 冷冻保存。

②Rh123 粉：用甲醇配制 l0 mg/mL 储存液，每管分装 100ul，-20℃，冷冻保存。

造血干细胞特征分析的实验步骤如下：

（一）骨髓细胞收集

A. 切下股骨、胫骨和骼骨嵴，无菌外科手术刀刮掉附着的肌肉和组织。放入冷的 2% HiSe PBS 中。

B. 无菌研钵和碾槌碾碎骨头，用 40um 尼龙细胞滤器过滤细胞悬液，去除骨碎片。

C. 在无菌的 50 mL 离心管中用等体积的 3 mg/mL 胶原酶和 3 mg/mL 分散酶，重悬骨碎片，置于 37℃ 定轨振荡器孵育至少 5 min。向试管中加入 25 mL 2% HiSe PBS, 剧烈振摇，小心倒岀细胞悬液，通过 40um 尼龙细胞滤器过滤。再用 25 mL 2% HiSe PBS 重悬骨碎片，如前操作，小心倒出细胞悬液。

D. 在 4℃ 条件下,400 g 离心细胞悬液 5 min。用 2% HiSe PBS 重悬细胞。收集所有骨髓细胞离心，用过量 2% HiSe PBS 洗 2 次，调整细胞密度约 107/mL。

（二）低密度细胞收集

A. 在 50 mL 离心管中，将 20 mL 骨髓细胞悬液小心加在 10 mL 1.077 g/mL Nycoprep 分离液的表层。关闭离心机刹车，低温离心（4℃ 条件下 600 g 离心 20 min）。

B. 在 Nycoprep 分离液界面收集低密度单个核细胞，加入过量的 2% HiSe PBS, 洗涤、离心 2 次，再重悬于 2% HiSe PBS, 并计数。

（三）免疫磁珠的阴性选择

A. 分散低密度骨髓细胞，重悬并调节细胞浓度至 l08/mL, 加入生物素直接标记的 CD3, CD4 ,CD5 , CD8 , B220, Grl, Mac-1 和 TERI 19 抗原的组合抗体，冰上孵育 30 min。

B. 同时，另外准备两小份低密度骨髓细胞，作为 Lin-抗原参考设门。一份单独加入 StreP-PE 孵育，另一份加入 StreP-PE 和与相关谱系抗体蛋白浓度相同的同型对照组合抗体。

C. 用过量 MACS 标记缓冲液洗涤标记细胞，离心（400 g 4℃ 离心 5 min）去除残留的未结合的抗体。再在 MACS 标记缓冲液中重悬细胞。

D. 细胞计数。取其中一小部分标记细胞（2.5×105）加入 Strep-PE 孵育，作为 MACS 分选前对照，用于:①流式细胞对免疫磁珠阴性选择的分选效果评价;②校正荧光补偿设置;③设置分选门，将在 Hodull/Rhdull 细胞分离方法中污染的谱系阳性细胞排除在外。

E. 将剩余的细胞悬液再次离心（4℃ 条件下 400 g 离心 5 min）, 倒掉上清，留下干的细胞团。

F. 再次用 90ul 标记缓冲液和按每 107 细胞 10ul 链霉亲和素微球标记细胞。间歇搅拌，充分混匀，冰浴 15 min。

G. 微球孵育后，按每 107, 细胞用 1-2 mL MACS 分离缓冲液洗涤标记细胞（4℃ 条件， 400 g 离心 5 min）。用 MACS 分离缓冲液重悬细胞，并将细胞浓度调整为 108/500ul。

H. 在抗体和微球标记过程中, 选择一个先前描述的合适的 MACS 分离柱，准备安装，按照提供的操作说明书介绍放在磁分离器中。

I. 把细胞悬液加入到洗涤后的分离柱中，把阀门打开至工作位置, 让细胞最大程度地穿入至分离柱中。用相当于 3-5 倍分离柱体积的 MACS 分离缓冲液洗涤分离柱, 收集磁珠阴选的细胞，即为造血干细胞谱系阴性细胞。

（四）Rh123 和 Ho 染色

A. 在低密度、谱系阴性细胞悬液中, 按每百万细胞，加入每种荧光素 10ul, 轻轻搅匀细胞悬液, 在暗处 37 ℃ 水浴中孵育 30mim。

B.Rhl23 和 Ho 染色后，通过无染料缓冲液 37℃2 次孵育，根据细胞膜染料泵出活性，分离细胞。

C. 室温离心 Rh123/Ho 染色细胞（400 g 离心 5 min）, 沉淀用预温的无染料 5% HiSe PBS 悬浮细胞至 1 xl06/mL, 在暗处 37℃ 无水浴 15 min。

D. 离心沉淀细胞，重复染料泵出步骤 1 次。

E. 重复染料泵出步骤后，取出一部分 Rhl23/Ho 染色细胞（2.5 xl0⁵）冰浴保存, 作为流 式细胞分析对照。

F.3.4.6 离心剩下的细胞悬液，用 Strep-PE 重悬细胞至浓度为 1 xl08/mL, 避光冰浴 30 min, 用来检测残留污染的谱系分化抗原阳性造血细胞。

G. 加入过量的 0.25% HiSe PBS, 离心细胞悬液，使细胞形成细胞团，用 0.25% HiSe PBS 重悬细胞至（5-10）x 106/mL。加 7-AAD 贮存液（1：50 V/V）至终浓度为 2 ug/mL。将标记细胞保存于冰上，为流式细胞分析和分选作准备。