材料与仪器
母鼠
PBS 胰蛋白酶溶液 DNase 溶液
无菌解剖器械 不锈钢滤网 烧瓶 培养箱
PBS 胰蛋白酶溶液 DNase 溶液
无菌解剖器械 不锈钢滤网 烧瓶 培养箱
步骤
1. 准备下列试剂和材料:
确定怀孕期的母鼠(孕期14至6天)
无菌解剖器械(镊子、剪刀、手术刀片)
Cellector 带收集装置的不锈钢滤网,1 mm 直径筛网
内有搅拌棒的 125 ml 无菌的胰蛋白酶消化的烧瓶
有搅拌盘的培养箱
无 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS
胰蛋白酶溶液
DNase 溶液(10 mg/ml)
MEF 生长培养基
MEF 冻存培养基
150 mm 和 100 mm 组织培养皿
2 ml 冷冻管
2. 杀死怀孕 14~16 天的母鼠,取出子宫,放在盛有 PBS 的 100 mm 组织培养皿中,取出胚胎,去胚胎外组织,PBS 冲洗去血。
3. 用无菌镊子去胚胎头和内脏。
4. 胚胎转移到盛有 40 ml PBS 的 50 ml 无菌离心管中,轻轻颠倒两次。小心倒掉 PBS,再加 40 ml PBS 清洗。倒掉 PBS,留 10 ml 将胚胎转移到 100 mm 培养皿。
5. 手术刀片细细切碎胚胎,用镊子挤压使其通过无菌滤网。15 ml 胰酶溶液冲洗滤网两次,解剖胚胎混合物转移至 125 ml 胰酶消化的烧瓶。加 400 μl DNase 粗品,以免释放出的 DNA 导致溶液过黏。
6. 湿润的 5% CO2 温箱中 37℃ 轻轻搅动孵育 30 分钟。
7. 由烧瓶侧臂把上层细胞悬液倒入一装有 10 ml MEF 生长培养基的 50 ml 离心管。
8. 离心收集细胞。
9. 30 ml MEF 生长培养基洗两次。
10. 细胞悬于 15 ml 生长培养基,用血细胞计数可存活有核细胞(非血红细胞或碎片)。10 只 15 天幼鼠可获得 5X107 到 1X108 细胞。
11. 6X106 细胞悬于 25 ml MEF 生长培养基,接种一块 150 mm 培养皿(总计接种 10~15 块)。
12. 24 小时后更换新鲜 MEF 生长培养基。
13. 约 2~4 天后细胞长满,1:5 传代。分 8 批操作,15 ml PBS 冲洗,倒掉,加 10 ml 胰酶溶液,37℃ 孵育 5 分钟。
14. 每块胰酶消化的细胞板加 10 ml 生长培养基,轻柔吹吸,分散细胞,转移到 50 ml 离心管,两块板的细胞合并到一管中。
15. 离心收集细胞。细胞悬于培养基中,1:5 分加到 150 mm 培养皿。
16. 约 3 天后细胞长满,可以收获冻存于液氮中。分 8 批操作,15 ml PBS 冲洗,倒掉,加 10 ml 胰酶,37℃ 孵育 5 分钟。
17. 加 10 ml MEF 生长培养基,轻柔吹吸,分散细胞,转移到 50 ml 离心管。
18. 离心收集细胞。每块培养皿收获的细胞悬于 2 ml 冻存培养基。
19. 每支冷冻管加 1 ml 细胞,旋紧盖子,-80℃ 冰箱过夜。此步操作需迅速。
20. 第二天将细胞转移至液氮中。转移过程中需放在干冰上避免升温。
确定怀孕期的母鼠(孕期14至6天)
无菌解剖器械(镊子、剪刀、手术刀片)
Cellector 带收集装置的不锈钢滤网,1 mm 直径筛网
内有搅拌棒的 125 ml 无菌的胰蛋白酶消化的烧瓶
有搅拌盘的培养箱
无 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS
胰蛋白酶溶液
DNase 溶液(10 mg/ml)
MEF 生长培养基
MEF 冻存培养基
150 mm 和 100 mm 组织培养皿
2 ml 冷冻管
2. 杀死怀孕 14~16 天的母鼠,取出子宫,放在盛有 PBS 的 100 mm 组织培养皿中,取出胚胎,去胚胎外组织,PBS 冲洗去血。
3. 用无菌镊子去胚胎头和内脏。
4. 胚胎转移到盛有 40 ml PBS 的 50 ml 无菌离心管中,轻轻颠倒两次。小心倒掉 PBS,再加 40 ml PBS 清洗。倒掉 PBS,留 10 ml 将胚胎转移到 100 mm 培养皿。
5. 手术刀片细细切碎胚胎,用镊子挤压使其通过无菌滤网。15 ml 胰酶溶液冲洗滤网两次,解剖胚胎混合物转移至 125 ml 胰酶消化的烧瓶。加 400 μl DNase 粗品,以免释放出的 DNA 导致溶液过黏。
6. 湿润的 5% CO2 温箱中 37℃ 轻轻搅动孵育 30 分钟。
7. 由烧瓶侧臂把上层细胞悬液倒入一装有 10 ml MEF 生长培养基的 50 ml 离心管。
8. 离心收集细胞。
9. 30 ml MEF 生长培养基洗两次。
10. 细胞悬于 15 ml 生长培养基,用血细胞计数可存活有核细胞(非血红细胞或碎片)。10 只 15 天幼鼠可获得 5X107 到 1X108 细胞。
11. 6X106 细胞悬于 25 ml MEF 生长培养基,接种一块 150 mm 培养皿(总计接种 10~15 块)。
12. 24 小时后更换新鲜 MEF 生长培养基。
13. 约 2~4 天后细胞长满,1:5 传代。分 8 批操作,15 ml PBS 冲洗,倒掉,加 10 ml 胰酶溶液,37℃ 孵育 5 分钟。
14. 每块胰酶消化的细胞板加 10 ml 生长培养基,轻柔吹吸,分散细胞,转移到 50 ml 离心管,两块板的细胞合并到一管中。
15. 离心收集细胞。细胞悬于培养基中,1:5 分加到 150 mm 培养皿。
16. 约 3 天后细胞长满,可以收获冻存于液氮中。分 8 批操作,15 ml PBS 冲洗,倒掉,加 10 ml 胰酶,37℃ 孵育 5 分钟。
17. 加 10 ml MEF 生长培养基,轻柔吹吸,分散细胞,转移到 50 ml 离心管。
18. 离心收集细胞。每块培养皿收获的细胞悬于 2 ml 冻存培养基。
19. 每支冷冻管加 1 ml 细胞,旋紧盖子,-80℃ 冰箱过夜。此步操作需迅速。
20. 第二天将细胞转移至液氮中。转移过程中需放在干冰上避免升温。
注意事项
来源:丁香实验