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神经干细胞的分离、鉴定和移植

相关实验:神经干细胞的分离、鉴定和移植实验

最新修订时间:

原理

解剖并取出胚胎或成体大脑的特定部位,采用酶消化法消化组织从而使细胞从粘连的组织中解离,然后通过聚乙烯吡咯烷酮(Percoll) 密度梯度离心(非必须)去除其他细胞和组织碎片,从而获得部分纯化的干细胞,并进行接种(图 11-1)。

材料与仪器

步骤

材料




步骤

一、胚胎和成体CNS部位的解剖

有关胚胎和成年大鼠的海马和脊髓组织的解剖在这里只作简单介绍,更为详细的实验介绍可参见第十四章。

胚胎CNS

1.腹腔注射麻醉剂使孕鼠深度麻醉,复合麻醉剂成分为:盐酸氯胺酮(ketamine,44 mg/kg),马来酸乙醜丙嗪(acepr〇mazine,4?Omg/kg)和甲苯噻嚷(romPun,0.75 mg/kg)。

2.切开腹部,取出子宫双角,放置冰上,从羊膜囊内取出胚胎置于冷的D>PBS中。

3.测量胚胎的顶-臀长度,以确定胎龄。

海马

1.取下胚胎大脑并置于D-PBS中。用镊子固定胎脑,从中线向一侧撕开皮层并将其平放,用尖头镊子夹住组织,在皮层下方,用弯头眼科剪切下海马。

2.于显微镜下,将海马组织转入D-PBS中。

3.从对侧取下海马,用尖头镊子剥去附着的脑膜和血管组织,收集并混合15~20个胚胎的海马。

脊髓

1.于显微镜下,使胚胎侧卧于无菌的I>PBS中,用眼科剪从椎管侧面剪开,并在对侧做一同样切口,在颈段和腰部下端离断脊髓。

2.取出脊髓,并剥离周围附着的组织,收集并混合15~20个胚胎的脊髓。

成体中抠神经系统海马

1.将成年(3~6个月)雌性Fisher344大鼠麻醉,断头处死,取出大脑并置于含有冷的D-PBS的平皿中。

2.在显微镜下切断胼胝体,于丘脑上方分离左、右大脑皮质,向后翻起大脑皮质半球的后缘,沿两侧海马的内外侧缘分离穹隆和海马辙,取出海马。

成体脊髓

将大鼠麻醉,使其侧卧,从侧面切开椎管,从对侧做一同样切口,小心取出脊髓,剥离附着于脊髓上的结缔组织,于显微镜下,分别解剖出骶、胸、腰、颈段。

二、胚胎中枢神经系统区域的原代培养的建立

A .大鼠神经干细胞在FGF-2条件下的单层培养(Ray et al. 1993) 1 . 将切碎的组织移入含5mll> PBS的 15ml离心管中,轻弹管壁,重悬组织,离心 (lOOOg, 3min),重复 3 ~ 4 次。 2 . 将组织重悬于Iml的 DMEM:F12培养液中,用过火的平头细口巴氏吸管( 管径 为 1.0~1.5_)反 复 吹 打 组 织 块 ( 约 2 0 次),使其成为单细胞悬液,吹打时避免吹出 气泡。 3 •用DMEM:F12培养液洗组织细胞1〜2 次,离心去除碎片,用巴氏吸管吹打5〜 10次,制备成单个细胞悬液。 4 . 将细胞悬液稀释至适当的密度后进行计数,调整细胞密度,并 以 (1~2) XlO4 个细胞/cm2 的密度将细胞接种于经PORN或 P〇 RN/Laminin包被的平皿上。 5 •根据培养细胞的汇合程度,每 隔 3〜4d 换 液 1 次,如果细胞密度较低,可换半 量,但必须增加FGF-2的加入量,使其终浓度维持在2〇 ng/ml〇 B•小鼠神经干细胞在EGF条件下的培养( Reynolds etal. 1992; Reynolds, Weiss 1996) 1•用DMEM:F12培养液清洗已分离的组织,如前所述,用巴氏吸管反复吹打以机 械分散组织。 2 . 制成单细胞悬液后计数,以 2500个细胞/cm2 的密度将细胞接种于经PORN包 被的盖玻片上( 置 于 2 4 孔培养板内),在含有2〇 ng/ ml EGF的 N2 培养液中培养细胞。 3. 10~14d 后,更换新鲜培养液,此后,每隔2~ 4 d换 液 1 次。

三、成体CNS 来源的神经干细胞培养系统的建立


3 •通过胰酶消化的方法对生长为单层的细胞进行传代并接种到未经包被的培养皿 内 ( 方法见下)

四、克隆培养细胞的分离

分离克隆细胞的主要目的是为了证实干细胞具有产生神经细胞和胶质细胞的多能 '注,培养克隆细胞的方法有两种。 有限稀释法( limiting dilution) 1•将细胞以克隆密度(1~2个 细 胞 /孔, 9 6 孔 ;或 1 个细胞/7cm2, 35mm平皿) 接种于经PORN/Laminin包被的平皿中。采用含有合适生长因子的无血清N2 培养液。 2 . 为跟踪某个细胞,可以在平皿底部相应部位作一划痕。干细胞易于迁移,所以 必须确定在不同时间跟踪的是同一细胞。 3 . 每 隔 4~53换液一次,用 含 £〇 ?或 ?&^2 ( 2 0 明 / 1111)的培养液并添加50%的 条 件培养液( 从高细胞密度的培养液中收集而来,方法见后)。因为处于低密度培养的 细胞不能有效地改善其自身的生长环境,而在条件培养液中则存在很多因子,它们将支 持克隆细胞的存活和增殖。 4 . 当克隆细胞的密度达到>1〇〇个细胞/克隆时,可将细胞进行传代和扩增,或通 过免疫细胞化学染色的方法鉴定克隆细胞群。 利用细胞的遗传标记建立克隆培养细胞 1•用经过有限稀释的逆转录病毒载体感染神经干细胞,此反转录病毒载体可选择 性表达标记基因,如 绿 色 荧 光 蛋 白 ( GFP)、大 肠 杆 菌 LacZ基因,或碱性磷酸酶 (Suhonen et al. 1997)。 2 •接种1% 的细胞到含有G418的培养液中。 G418的含量应选用能使转染细胞被筛 选的最小剂量。通常情况下可从40jLtg/ml起始,缓慢增至10(Vg/ml。为增加筛选过程 中细胞的存活率,应逐渐增加G418的浓度并在培养液中添加50 % 从高细胞密度培养液 中所收集的条件培养液。 3 •每隔3 ~ 4 d 换 液 1 次,直到出现增殖的细胞簇, 一旦转染稳定可停止筛选,但 应定期筛选细胞,以去除那些已丢失标记基因的细胞。 4 . 每个细胞克隆的传代可采用琼脂糖/胰 酶 法 ( 方法见后)。 5 . 通过Southern Uot分析,可 确 定 培 养 细 胞 的 克 隆 形 成 能 力( Sambrook et al. 1989)。简言之,先通过裂解细胞制备基因组DNA,并用特定的限制性内切酶( 可切割 载体或病毒的长末端重复序列)水解,然后借助于琼脂糖凝胶电泳来分离已水解的 DNA片断,并将其转移至尼龙膜上,最后用32P标记的探针„eo或转基因的特异性探针 作分子杂交,从而检测基因组DNA的特定序列定位。

五、干细胞的免疫细胞化学染色的鉴定(Petersonetal.1996)

除特别指出外,所有的染色步骤均在室温条件下进行,染色过程中的每一步清洗均 为 IOmin0 1 . 将大鼠或小鼠来源的千细胞培养于经PORN/Laminin包被的分格式载玻片上, 直 至 50 % ~70 % 的细胞汇合。
2 ■用4 % 多聚甲醛固定细胞lOmin,用 1 0 0 _ d /L T B S 缓冲液清洗细胞两次,固 定后的标本可立即进行免疫细胞化学染色,也可置于T B S 中, 41: 保存约1 周。 3 . 用含有1 0 % 驴血清和0.25% Triton X-IOO的封闭缓冲液( T B S 配制) 孵育标本 至少 l h 。 4. 条件下,将标本与含联合抗体( 单抗和多抗)的 T B S + 稀 释 液 ( 含 0.25% TritonX-IOO) 共同孵育。如所用的抗体能识别细胞表面分子,则可免去缓冲液中的 Triton X-IOO0 5. 24〜48h 后,用封闭缓冲液清洗标本3 次,避光条件下,将标本在二抗溶液中孵 育 2h,二抗为荧光素( F IT C 、 T e x a s R e d 、 cy-5或 cy-3)标记的、用 TBS+ 稀释的抗第 一抗体的种属特异性抗体。 6 . 用 T B S 清洗标本2 次,将标本在含有D A PI (IO ngA ni) 的 T B S 中 孵 育 lm in, 然后滴上P A V -D A B C O 液,盖上盖玻片,于激光共聚焦或荧光显微镜下观察结果。 7 •为增强特异性抗原的信号,也可采用生物素_链亲和素( bi〇 tin-streptavidin) 的 方法,即将标本与一抗溶液孵育并经清洗后,再与生物素化的驴抗种属特异性抗体 (T B S +稀释)共同孵育2h,然后用T B S 清洗标本2 次后,将其在标记了荧光染料的链 亲和素溶液中孵育。 8 . 为了在同一细胞中同时检测细胞表面抗原和细胞核抗原或细胞质抗原,可选用 含 1 0 % 驴血清的T B S 预孵育标本,然后于室温条件下将标本与含抗表面抗原的一抗溶 液共赌育2h (或 41: 过夜)。经 T B S 清 洗 3 次后,用 4 % 多聚甲醛预固定标本5min, T B S 再清洗3 次,用封闭缓冲液预处理标本,以后的染色步骤同前。

六、干细胞的分化

七、用立体定位移植法将干细胞植入成年鼠脑

待移植动物的准备步骤与第十四章所介绍的胚胎细胞移植相似。此外,有关移植的步骤、动物的灌注、脑组织的切片以及用组织化学和免疫细胞化学染色方法对移植细胞的鉴定等一些更为详细的实验步骤可参见Suhonen等(1997)的实验。以下将这些方法作简单介绍。

移植细胞的制备

1 . 移植前3 〜5d,将已达到7 0 % 〜8 0 % 汇合程度的干细胞以1 :1 或 1 :2 的比例 传代。 2 • 力口入 BrdU 时,传代细胞应达到50 % ~ 60 % 汇合。于移植前2d 将培养液更换为 含有合适生长因子和5/Lonol/L BrdU (BrdU 的储存液浓度为5 _ ol/L ) 的新鲜培养液。 3 . 第二天,重复步骤2〇 4 ■用ATV-trypsin游离附着在培养瓶底的细胞,并将细胞转移至含D-PBS的 15ml 离心管内离心(1〇〇〇心3min),用 D-PBS清洗细胞2 次后,再用巴氏吸管将细胞重悬 于 D-PBS中。 5 . 用血细胞计数板计数细胞。 6 . 吸取适量细胞至〇.5ml Eppendorf管内,于微型离心机上离心Im in, 用含有 FGF-2 (20ng/ml) 的 I> PBS重悬细胞使细胞密度达到5 X 1〇4〜I X IOVfxI 以供大鼠移植 之用;至于小鼠移植,可用含EGF或同时含有FGF2 和 EGF两种因子和肝素的D-PBS 重悬细胞c

神经千细胞在成年大鼠脑中的移植

1 . 在神经干细胞移植前,可依据成年大鼠的脑图谱(PaxinosandWatson 1986) 确定注射位点I 也可以通过在立体定位仪下注射少量染料于鼠脑的特定位点来确定( 应 作为移植实验前的预实验,Suhonen et al. 1997)。 2 ■肌注麻醉剂以麻醉受体动物。 3 •刹去颅毛,用 Betadine消毒皮肤,将麻醉后动物放置于立体定位仪上。 4 •用10#刀片于动物双眼中点处沿中线做一切口至两耳中点,分离皮瓣,用棉球 擦干净颅骨表面和周围结缔组织的血迹广 5 . 确定前囟所在位置,在颅骨的合适位点处钻一个1 . 〇 _ 宽的小孔,用 26# 针挑 开硬脑膜。 6 . 轻弹储细胞的试管壁,使细胞重悬,用固定于立体定位仪上的微注射器吸取所 需量的细胞悬液(1〜 3汕 5¼ 104~ 1 XIO5 个细胞/必,避免出现气泡。' 7 . 降低注射针头,垂直进入硬脑膜直达所需深度( 定位原则:以前囟为标志,参 考立体定位图谱确定距前囟的前后距离,距中线的内外距离,及距硬脑膜的垂直距离), 缓慢注射所需量的细胞悬液,速度为每分钟I fxI 或 更 慢 (2 〜3/J )。 8 •注射完毕,将 针 头 上 升 1 _ ,原位留针2min,以防因拔针引起的细胞悬液扩 散,然后用l ~ 2 m in缓慢出针。 9 . 如还需在另一位点注射,重复以上操作步骤。 10. 将动物从立体定位仪上取下,清洁头颅,撒上抗生素粉剂,缝合切口,放回康 复笼中。

八、成年大鼠的灌注

详细的实验步骤可参见Suhonen等 (1997)的实验。 1. 于手术后一定时间内麻醉动物。 2 . 用灌注泵,以 约 lOOOml/h的流速给动物心内灌注〇.9% 冰 盐 水 (5〇 ml/只大
鼠),然后用4 % 多聚甲酸灌流固定( 用量为250ml/只大鼠;如仅灌注头部, 150m l即 可) , 若需做电镜观察或做染色时某些抗体要求戊二醛作固定,则 可 加 0.1%戊二醛于 固定液,本实验系统中采用低浓度的戊二醛将不会影响组织抗原性。 3 •取出鼠脑,转移至固定液内作后固定,此时将标本置于震荡台上于41:条件下过 夜。第二天,将鼠脑转移至含3 0 % 蔗 糖 溶 液 中 ( 用 0.1m〇 l/LNa3PO4 配制, PH7.2), 41C条件下,保持3d 或直至切片前组织沉底。如实验要求新鲜标本,可省略蔗糖处理 步骤。

九、大鼠脑切片

1.为便于在冰冻切片机上切片,应尽可能将包含所需靶区域的脑组织块修剪至最小。

2.将修剪好的脑组织用OCT包埋并固定在冰冻切片机的夹具上,再用干冰冻15 min。OCT包埋可有助于组织紧贴于冻头。

3.切片,并将切下的组织片转移至含有TCS的组织培养板的孔内(24或96孔板),此切片可长期储存于—20”C冰箱内

十、细胞培养板的包被


周后使用,且效果无明显变化。

十一、Perodl密度梯变离心法纯化干细胞

通过P ercoll密度梯度离心,可以去除污染的组织碎片和其他细胞,从而使干细胞得 以部分纯化。 1•按9 份 Perooll, 1 份 10X:PBS的 比 例 ( V/V),稀释Percoll储存液。 2 ■为获得不连续的PercoIl密度梯度,可在此基础上,制备实验所需的不同浓度 (50%、 4 0 % 、 3 0 % 、 2 0 % 和 1 0 % ) 的 Perooll梯度液,并将来源于酶消化和过滤后的细胞 悬液铺于 Perooll 梯 度 上 (Marie etal. 1997)。 3 . 室温条件下,离屯、 (400私, 20~30m in)。 4 . 收集分布于40% ~ 5 0 % P_ U梯度层之间的细胞。 5 . 将细胞用冷的PBS (含抗生素和两性霉素B) 稀释2〜5倍后离心(1〇〇〇 茗, 3min), 重复3 次。由于细胞沉淀较少,所以每次离心后,不应把上清液全部吸弃,而应留Iml左 右液体,以避免细胞丢失。 6 . 用 Iml培养液重悬细胞,取样计数,并以 个细胞/75on2 培养瓶]的密度接种细胞,如获得的细胞数较少,可将细胞接种于35mm 或 60mm的平皿中。 7 •通过Percoll连续密度梯度离心同样可分离纯化干细胞。将细胞与;Per00Il (1:1)混 合, i^ Li'后收集分布于上层( 髓憐脂层, myelin Iayor) 和 底 层 ( 红细胞层)之间的液体。 以后的操作可重复步骤5 和 6。

十二、神经干细胞的传代和再培养

单层细胞的培养

1 . 在已经预温(37T:) 的 IOcm培养皿或T75培养瓶中加入1.0~ 1.5ml ATV-胰酶 (X扞更小的平皿可适当少力口些),不断摇动培养皿( 瓶),使消化液均匀分布。 2 . 静 置 Imin,轻轻敲击培养皿( 瓶)的边缘,以促使细胞脱离培养皿( 瓶)的底面。 3•用P B S 重悬细胞,并移至15m l无菌离心管中,用 P B S 清洗培养皿( 瓶) 1 次,洗 液移至同一离心管,离 心 (1000^ 3min)。 4 . 慢慢吸弃上清液,注意不要搅混细胞沉淀,然后将细胞重悬于lmi 无血清N 2 培养 液中,用巴氏吸管轻轻吹打。 5 . 细胞接种数可以根据原代培养的细胞密度及其生长率而定,如果是大鼠来源的细 胞,应接种于经PORN/Laminin包被的板,采用含FGF-2的无血清N2 培养液;对于小鼠 来源的细胞应接种于未经包被的板,采用含EGF和 FGF_2 以及肝素的无血清N2 培养液。 6 . 根据需要,可将细胞冷冻于液氮中长期保存。

神经球的传代

1.收集含有神经球的培养液并转移至15 ml无菌离心管中,离心(1000次,3 min), 缓慢吸弃上清液,注意不要搅混细胞沉淀。

2.用Iml含有EGF的无血清 N2 培养液重悬细胞,并用中等口径的巴氏吸管轻轻吹打10~20次,使其成为单细胞悬液。

3.将细胞接种于未经包被的培养皿内或冷冻于液氮中长期保存。

细胞冷冻

1.将细胞重悬于含1 〇%DMSO和合适生长因子的无血清N2培养液中。

2.用吸管轻轻吹打,使细胞均匀,然后以lml/管分装于无菌的冷冻管内。

3.将冷冻管直立放入泡沫小盒内,并置于一701〇冰箱,使细胞在冷冻过程中缓慶降温。

4.第二天,将细胞冷冻管移入液氮容器内。

冷冻细胞的复苏和培养

1.从液氮中取出冷冻细胞,立即投入37TC7JC浴中并不时摇动,令其尽快融化。

2.用DMEM:F12培养液稀释此融化细胞,并转移至15 ml无菌离心管中离心(lOOOg,3 min),吸弃上清液。

3.用培养液洗细胞1 次,然后将细胞重悬于Iml无血清N2培养液中,用中等口径巴氏吸管轻轻吸打,使其成为单细胞悬液。

4.将大鼠来源的细胞接种于经PORN/Laminin包被的培养皿内;将小鼠来源的细胞接种于未经包被的培养皿内,采用含合适生长因子的无血清N2培养液。

克隆细胞的传代(璋脂糖/胰酶法)

1.从培养皿中挑选相对较大(>1〇〇个细胞/克隆)且分离较好的克隆,并在培养皿背面做好标记。

2.于微波炉内融化 3% 的琼脂糖溶液(agarose; 用 PBS 配制),待冷却至 45~50℃时,将 1ml 琼脂糖溶液与 2 mlATV-胰酶混匀,于 37℃条件下保温。

3.吸弃培养皿内的培养液,立即加入琼脂糖/胰酶混合液,轻轻摇动平皿,使液体流遍细胞表面,待凝固 2~3 min。

4.用无菌巴氏吸管沿各细胞克隆四周轻轻割下,挑出粘附有克隆细胞的琼脂糖胶,逐一移至 24 孔板的各孔中(孔内含有添加了 50% 条件培养液和 G418 的无血清N2培养液),然后,在原先细胞克隆的生长处,用少量(IOOul) 培养液洗 2 次,洗液一并移入 24 板的相应孔内。

5.每隔 3~4d 换液 1次,直到培养的细胞达到所需的汇合度,准备传代。

十三、条件培养液的制备

1.从高细胞密度的培养液中(至少培养 24 h 以上)收集条件培养液。

2.离心(1 000 g,5 min),分装成小份后冻存。为了防止残留细胞的污染,也可将条件培养液过滤。

十四、脑切片的分析

移植的干细胞在体内的特性及其命运可通过免疫细胞化学染色、原位杂交和电镜观^等进行分析,这里仅介绍免疫细胞化学染色的方法。.

1.为检测 BrdU, 将 CNS来源的组织切片漂于 5%formamide/2XSSC 液中进行预处理(65T:,2 h), 然后,将切片置于 2mol/LHa 中,于 37℃ 孵育 30 min。

2.预处理过的切片分析采用上述的免疫细胞化学染色法,并可通过激光共聚焦或^光显微镜观察其特异性标志蛋白的表达,BrdU 和特异性标志蛋白的共定位将用以确定移植细胞在体内的命运。

脑切片的细胞数可通过无偏倚立体学法(unbiasedstereology) 来确定,该方法曾有过详细介绍(Sterio1984;Petersonetal.1994;WestandSIomianka1998),这里仅作简要介绍。

1.将包含研究对象的组织进行系列切片,以相同的、随机的方法抽取样本。依视觉解剖器原则(opticaldissectorprinciple) 存在于组织中的所有细胞被抽样计数的机会应该均等。

2.根据视觉解剖器的抽样原则,在三维无偏倚计数网格中直接计数细胞。

3.通过视觉分段步骤(theopiticalfractionatorprocedure) 可直接从已知的样本计算总体细胞数,或可将由视觉解剖计数中所获的密度值与由 Cavalieri 步骤(Nv-VRef 步骤)所估算的整个结构的体积相结合而得知。

来源:丁香实验

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