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肝中DNA的分离和鉴定

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[原理]

细胞内的核酸多以核蛋白的形式存在,其中脱氧核糖核蛋白主要存在于细胞核中,核糖核蛋白主要存在于细胞质中。这两类核蛋白在0.14mol/L氯化钠溶液中的溶解度相差很大,核糖核蛋白在此溶液中具有很高的溶解度,脱氧核糖核蛋白的溶解度却相当低。

制成肝匀浆后,用0.14mol/L氯化钠溶液抽提,可将两种核蛋白分离。分离过程中加入少量柠檬酸钠,可抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的水解作用。

SDS(十二烷基硫酸钠)能使脱氧核糖核蛋白产生解聚作用,在含有脱氧核糖核蛋白的溶液中加入SDS,DNA即与蛋白质分离开,用氯仿将蛋白质沉淀除去,而DNA溶解于水相,最后用冷乙醇将DNA析出,而获得纯化的DNA。

在氯仿中加入少量异戊醇能减少操作过程泡沫的产生,并有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白,下层有机溶剂相维持稳定。

DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值,蛋白质则在280nm处有很高的吸收峰值。利用这个原理,我们测定纯化样品在260nm和280nm处的吸光度,可以推算出样品中DNA的浓度,并判断其纯度。

用标准样品测得在波长260nm处,1ug/ml 双链DNA钠盐吸光度为0.02,单链DNA钠盐为0.025(光程为1cm),即A260=1时,样品中双链DNA浓度为50 ug/ml,单链DNA浓度为40 ug/ml。纯净的DNA样品A260/A280的比值约为1.8,样品中含有蛋白质或其它杂质,会使A260/A280的比值下降。

A260/A280的比值大于1.6基本能达到各种后继实验的要求。

[仪器]

玻璃匀浆器 离心机 试管 刻度吸管 UV9100紫外可见分光光度计

[试剂]

(1)0.9%氯化钠溶液。

(2)10%氯化钠溶液。

(3)0.14mol/L氯化钠溶液(含0.01 mol/L柠檬酸钠):称取氯化钠8.182g和柠檬酸钠-2H2O 2.941g,用蒸馏水溶解并稀释至1000ml。

(4) 95%乙醇溶液(冷藏)

(5)5%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液:称取25克SDS溶于500ml 45%乙醇。

(6)氯仿-异戊醇混合液: 氯仿/异戊醇=24/1。

(7)0.1mol/L NaOH

[操作]

1.肝匀浆制备:新鲜兔肝,用0.9% NaCl洗去血液,除去结缔组织,剪碎,称取4g肝组织,加4ml 0.14mol/L NaCl溶液,匀浆器中研磨,制成肝匀浆。

2.分离核蛋白:肝匀浆倒入试管中,4000rpm离心5min,上清弃去。沉淀加2 ml 0.14 mol/L NaCl搅匀后再置匀浆器中研磨,4000rpm离心5min,上清弃去,沉淀重复上述操作, 上清弃去,沉淀为DNA-蛋白质复合物。

3.沉淀中加0.14mol/L NaCl 2.0ml,搅匀,滴加5%SDS 2.0ml,边加边搅,60℃水浴10 min(不停搅拌),冷至室温,均匀分成两管为Bl、B2。

4.B1、B。管中各滴加氯仿-异戊醇液4.0m1(边加边搅),搅至溶液颜色均匀,3000rpm离心15min。溶液分三层,上层液为水相(含DNA),中层为蛋白质沉淀,下层为有机相,吸取B1、 B2上层液合倒于另一试管中。

5.上清液加95%冷乙醇4.0ml,混匀(颠倒混匀法),3000rpm离心15min,去上清液,沉淀为纯化DNA。

6. DNA的溶解:沉淀中加入0.1 mol/L NaOH 4.0ml,搅拌溶解,2000rpm离心10min,上清液则为DNA水解液。

7.DNA的测定:用0.1mol/L NaOH 将样品稀释到一定浓度,以0.1mol/L NaOH 调零,测定样品的A260和A280,计算出每克肝组织中的DNA含量,并判断纯化DNA的纯度。

[注意事项]

(1)在制备肝匀浆时,应尽量在冰冷条件下进行,并尽快加入含0.01 mol 乙柠檬酸钠的 0.14mol/L氯化钠溶液,以抑制脱氧核糖核酸酶,防止DNA的分解以提高核酸得量。

(2)各步骤操作应力求准确,尽量减少中途核酸的丢失,保证定量测定的准确性+

(3)稀释后应该尽量使样品A260和A280处于0.1~0.7的范围内。

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