肝中DNA的分离和鉴定

[原理]

细胞内的核酸多以核蛋白的形式存在，其中脱氧核糖核蛋白主要存在于细胞核中，核糖核蛋白主要存在于细胞质中。这两类核蛋白在0.14mol／L氯化钠溶液中的溶解度相差很大，核糖核蛋白在此溶液中具有很高的溶解度，脱氧核糖核蛋白的溶解度却相当低。

制成肝匀浆后，用0.14mol／L氯化钠溶液抽提，可将两种核蛋白分离。分离过程中加入少量柠檬酸钠，可抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的水解作用。

SDS(十二烷基硫酸钠)能使脱氧核糖核蛋白产生解聚作用，在含有脱氧核糖核蛋白的溶液中加入SDS，DNA即与蛋白质分离开，用氯仿将蛋白质沉淀除去，而DNA溶解于水相，最后用冷乙醇将DNA析出，而获得纯化的DNA。

在氯仿中加入少量异戊醇能减少操作过程泡沫的产生，并有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白，下层有机溶剂相维持稳定。

DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值，蛋白质则在280nm处有很高的吸收峰值。利用这个原理，我们测定纯化样品在260nm和280nm处的吸光度，可以推算出样品中DNA的浓度，并判断其纯度。

用标准样品测得在波长260nm处，1ug/ml 双链DNA钠盐吸光度为0.02，单链DNA钠盐为0.025（光程为1cm），即A260＝1时，样品中双链DNA浓度为50 ug/ml，单链DNA浓度为40 ug/ml。纯净的DNA样品A260/A280的比值约为1.8，样品中含有蛋白质或其它杂质，会使A260/A280的比值下降。

A260/A280的比值大于1.6基本能达到各种后继实验的要求。

[仪器]

玻璃匀浆器 离心机 试管 刻度吸管 UV9100紫外可见分光光度计

[试剂]

(1)0.9％氯化钠溶液。

(2)10％氯化钠溶液。

(3)0.14mol／L氯化钠溶液(含0.01 mol／L柠檬酸钠)：称取氯化钠8.182g和柠檬酸钠-2H2O 2.941g，用蒸馏水溶解并稀释至1000ml。

(4) 95％乙醇溶液(冷藏)

(5)5％十二烷基磺酸钠(SDS)溶液：称取25克SDS溶于500ml 45％乙醇。

(6)氯仿-异戊醇混合液： 氯仿/异戊醇=24/1。

(7)0.1mol/L NaOH

[操作]

1．肝匀浆制备：新鲜兔肝，用0.9％ NaCl洗去血液，除去结缔组织，剪碎，称取4g肝组织，加4ml 0.14mol/L NaCl溶液，匀浆器中研磨，制成肝匀浆。

2．分离核蛋白：肝匀浆倒入试管中，4000rpm离心5min，上清弃去。沉淀加2 ml 0.14 mol/L NaCl搅匀后再置匀浆器中研磨，4000rpm离心5min，上清弃去，沉淀重复上述操作， 上清弃去，沉淀为DNA-蛋白质复合物。

3．沉淀中加0.14mol/L NaCl 2.0ml，搅匀，滴加5％SDS 2.0ml，边加边搅，60℃水浴10 min(不停搅拌)，冷至室温，均匀分成两管为Bl、B2。

4．B1、B。管中各滴加氯仿-异戊醇液4.0m1(边加边搅)，搅至溶液颜色均匀，3000rpm离心15min。溶液分三层，上层液为水相(含DNA)，中层为蛋白质沉淀，下层为有机相，吸取B1、 B2上层液合倒于另一试管中。

5．上清液加95％冷乙醇4.0ml，混匀(颠倒混匀法)，3000rpm离心15min，去上清液，沉淀为纯化DNA。

6． DNA的溶解：沉淀中加入0.1 mol/L NaOH 4.0ml，搅拌溶解，2000rpm离心10min，上清液则为DNA水解液。

7．DNA的测定：用0.1mol/L NaOH 将样品稀释到一定浓度，以0.1mol/L NaOH 调零，测定样品的A260和A280，计算出每克肝组织中的DNA含量，并判断纯化DNA的纯度。

[注意事项]

(1)在制备肝匀浆时，应尽量在冰冷条件下进行，并尽快加入含0.01 mol 乙柠檬酸钠的 0.14mol/L氯化钠溶液，以抑制脱氧核糖核酸酶，防止DNA的分解以提高核酸得量。

(2)各步骤操作应力求准确，尽量减少中途核酸的丢失，保证定量测定的准确性+

(3)稀释后应该尽量使样品A260和A280处于0.1~0.7的范围内。