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从重组溶源菌中制备粗提物鉴定DNA结合蛋白的活性

相关实验:编码 DNA 结合蛋白的 cDNA 克隆的检测、纯化和鉴定

最新修订时间:

材料与仪器

大肠杆菌 Y1089
含有或不含10 mmol L MgCl2的LB培养液 1010pfu mLλgtU重组噬菌体液 1 mol L IPTG 抽提缓冲液 5 mg mL溶于抽提缓冲液中的溶菌酶(保存于-20℃)
4 mol L NaCl 32℃培养箱 无菌牙签 0.025μm圆形滤膜(Millipore VS)

步骤

1) 37℃在LB/麦芽糖/氨苄青霉素培养液中培养大肠杆菌Y1089 hflA150生长至饱和。


2) 用LB/MgCl2培养液将细菌悬液稀释100倍,取100μL用5μL 1010pfu/mL λgtll重组噬菌体液感染,32℃温育。


3) 用LB培养液将被感染的细菌悬液稀释1000倍。取100μL涂于LB/氨苄青霉素平板上,32℃温育过夜,每平板可获得约100个菌落。


4) 试验单个菌落的温度敏感生长情况。用消毒牙签将各单菌落分别点种于2块LB/氨苄青霉素平板上。将其中1块置于42℃温育,另1块置于32℃温育。


能在32℃而不能在42℃生长的菌落为溶源菌,其出现频率应为10%〜80%。


5) 在LB/氨苄青霉素培养液中将重组噬菌体溶源菌于32℃培养过夜。


6) 取20μL过夜培养物接种于2 mL LB/氨苄青霉素培养液中。于32℃在有良好通风的情况下培养。


7) 当OD690=0.5 (约3 h)时,将温度调至44℃,培养20 min。


8) 加1 mol/L IPTG至终浓度为10 mmol/L,温度降低至37℃,继续培养1 h。


9) 取1 mL经诱导的培养物在室温下离心45 s。


10) 将沉淀重悬于100μL抽提缓冲液中,迅速在干冰/乙醇中冻结。如果需要,于-70℃保存细胞悬液。


11) 快速解冻细胞悬液。加5 mg/mL溶菌酶至终浓度0.5 mg/mL。在冰上放置15 min。


12) 加4 mol/L NaCl至终浓度1 mol/L,并彻底混匀。4℃在旋转式混合仪上温育15 min


13) 4℃离心30min,小心移出上清。


14) 将上清置于0.025μm的圆盘滤膜上,对100 mL抽提液4℃透析60 min。然后在干冰/乙醇浴中迅速冻结,并保存于-70℃。

来源:丁香实验

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