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编码 DNA 结合蛋白的 cDNA 克隆的检测、纯化和鉴定

实验分类:

生物化学实验

最新修订时间:

简介

一个DNA位点识别探针被用来从表达文库中检测合适的重组克隆,并对 之进行纯化,证明其中编码了具有一定序列特异性的DNA结合域。这种策略排除了为 分离其基因而对序列特异性DNA结合蛋白进行纯化的过程;只需要一个合适的构建于 λgtll载体中的cDNA文库和一个DNA识别位点的探针。

来源:丁香实验

操作方法

用位点识别DNA筛选λgtll表达文库

1) 用EcoRI和HindIII在100μL中消化20μg适当的pUC重组质粒DNA,释放出含有2〜10个蛋白质结合位点的插入片段。2) 在限制酶切反应中加入下列成分:1 mol/L Tris • Cl, pH 7.5,终浓度 50 mmol/L 、dCTP、dGTP、dTTP 各 5 mmol/L,终浓度 100μLmol/L 、200μ Ci [α32P] dATP (5000Ci/mmol

用盐酸胍进行干燥膜的变性/复性循环

1) 按基本方案步骤1〜15进行。2) 将平皿在4℃冷却10 min。用针扎孔标记各膜的位置。小心地揭起膜,室温下在空气中瞭干15 min。3) 将膜浸于HEPES结合缓冲液/6 mol/L盐酸狐中,4℃轻轻摇动温育10 min。在新 鲜的HEPES结合缓冲液/6 mol/L盐酸胍中重复1次。4) 将膜浸于HEPES结合缓冲液/3 mol/L盐酸胍(每10张膜50 mL)中,4℃ 5 min。 重

从重组溶源菌中制备粗提物鉴定DNA结合蛋白的活性

1) 37℃在LB/麦芽糖/氨苄青霉素培养液中培养大肠杆菌Y1089 hflA150生长至饱和。2) 用LB/MgCl2培养液将细菌悬液稀释100倍,取100μL用5μL 1010pfu/mL λgtll重组噬菌体液感染,32℃温育。3) 用LB培养液将被感染的细菌悬液稀释1000倍。取100μL涂于LB/氨苄青霉素平板上,32℃温育过夜,每平板可获得约100个菌落。4) 试验单个菌落的温度敏感生

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