DNA克隆与鉴定

基本概念
1）基因工程（genetic engineering）、基因克隆、DNA重组、DNA克隆、分子克隆。
2）克隆（clone）：无性繁殖——应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子（重组子），再通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因转化子，进行扩增、提取获得大量同一DNA，或其表达产物。
基因克隆的基本步骤
1）连接外源基因和克隆载体，构建重组DNA分子；
2）重组DNA分子转入受体细胞；
3）克隆载体在受体细胞中指导重组DNA分子复制；
4）外源基因随受体细胞分裂而得以复制、繁殖，并在受体细胞分裂时，重组DNA分子进入子细胞；
5）重组质粒的提取鉴定。
目的序列与载体的连接
1）粘性末端连接
（1）若DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端。
①相同内切酶产生的粘性末端，连接后得到的重组质粒保留原来的限制酶切位点。
②不同的内切酶产生的互补粘性末端，连接后得到的重组质粒不保留原来的限制酶切位点。
（2）单切酶
产生粘性末端，但载体发生自连，降低外源片段的插入。碱性磷酸酶去除载体5’-磷酸，抑制载体的自身环化。
（3）一般采用插入片段及载体两端具有两个相应的能够产生粘性末端的酶进行酶切后重组，不仅易于连接，而且又不能互补，取得较好的重组结果。
2）平端连接法
（1）平末端主要来自酶切后产生的平端和补平后产生的平端。
①酶切产生的平端：较易连接。
②有时插入片段和载体之间没有互补的末端，可将末端“补平”或去除3’突出端，再用连接酶连接两个平端。
（2）平端连接的效率是比较低
①提高DNA浓度或增加连接酶用量可提高平端连接效率；
②在平端加合成接头，产生粘性末端，可提高连接效率。
（3）载体及插入片段的量
适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用载体：插入片段摩尔数为1：2-3的比例。
（4）典型的连接反应体系：10μL
10×连接缓冲液 1μL
10mM ATP 1μL
质粒DNA 200ng-1μg
外源DNA 200ng-1μg
T4 DNA连接酶 0.5-2units
外源DNA导入宿主细胞
1）常用的基因工程菌：大肠杆菌HB101，DH5α，JM109
2）外源DNA导入宿主细胞的方法
（1）转化（transformation）
（2）感染（infection）
①转导（transduction）：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程。
②转染（transfection）：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。
3）转化：将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。
（1）原理：
①受体细胞一般是一些不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体，可容忍外源DNA进入体内并稳定遗传后代；
②受体细胞经过特殊方法处理，成为感受态细胞，细胞膜通透性发生暂时性改变，允许外源DNA分子进入；
③进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状，在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。
（2）感受态细胞制备方法：
化学法：CaCl2法
简便易行，转化效率可满足实验要求，制备的感受态细胞可-70℃保存。
4）转化方法
（1）热击法
使用化学试剂（如CaCl2）制备感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；
（2）电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。
提高转化效率的优化途径
1）细胞生长状态和密度
①用-70℃甘油保存菌种直接转接用于感受态细胞制备；
②细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，一般OD600=0.5。
2）质粒的质量和浓度
①质粒DNA应主要是超螺旋态DNA；
②转化效率与外源DNA浓度在一定范围内成正比，过高，转化效率低；
③一般DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。
3）试剂的质量
所用的试剂特别是CaCl2等需最高纯度，用超纯水配制。
4）防止杂菌和杂DNA的污染
在无菌条件下操作，所用器皿和试剂均应经高压灭菌处理。
克隆的筛选
1）主要用不同抗药性标记筛选
（1）抗氨苄青霉素（amp r）、抗四环素（terr）、抗卡那霉素（kanr）等；
（2）当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，把未接受载体DNA的细胞筛除；
（3）如外源目的序列插入在载体的抗药性基因中，抗药性基因失活，抗药性标志就消失。
重组质粒的筛选和鉴定
1）蓝白斑筛选 α-互补现象
许多载体带有LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸编码信息，编码α-互补肽。该肽段与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。当这种载体转入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在IPTG（异丙基-β-D硫代半乳糖苷）诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，他们各自都没有酶活性，但融为一体形成具有酶活性的蛋白质。这称为α-互补现象。
由互补产生的β-半乳糖苷酶（LacZ）能作用于生色底物X-gal（5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）而产生蓝色菌落。利用这个特点，在载体的该基因编码序列间放入多克隆位点，当插入外源DNA片段时，造成LacZ（α）基因的失活，破坏α-互补，就不能产生具活性的酶。有重组质粒的菌落为白色，没有重组质粒的菌落为蓝色。
2）质粒酶切鉴定
3）分子杂交
4）PCR
5）免疫 学方法
6）DNA限制性内切酶图谱分析
（1）从可能的阳性克隆中提取质粒