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编码15肽随机DNA片段的克隆

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1206
编码 15 肽随机 DNA 片段的克隆
 
    (1)M13KE载体的大量酶切
    双酶切反应 体系:
    M13KE载体(1ug)        2 ul
    H2 O                   32 ul
    10XNE Buffer 3         4 ul
    EagI(10 U/ul)          1 ul
    Acc65 1(10 U/ul)       1 ul
    (共40 ul)
    37℃孵育3h后,电泳纯化回收后,通过p―Agarase降解所含琼脂糖。
 
    (2)酶切载体与合成片段的连接:为确保连接效率的最大化,同时采用不同的反应体系进行预连接,在每20ul的反应体系中,按照表进行反应,然后在16C连接过夜。
 
反应体系
┌─────┬─────────────────┐
│          │    3:  l    5  :  l    10:  l │
├─────┼─────────────────┤
│    40 ng │     200UT4    200UT4    200U T4  │
│    100 ng│     200UT4    200UT4    200U T4  │
└─────┴─────────────────┘
 
    (3)电转化感受态菌的制备:在LB平板上划线接种ER2738菌株,37C培养16h。从LB平板上挑选单个菌落接种于1m1LB培养液中,37C、150r/min培养16h。取200ul菌液接种于10m1的LB培养液(含20%葡萄糖),37C、250r/min培养至A600=0.7~0.8(约3~4h),冰浴10min,4℃、5 000r/man离心10man,弃上清液,并倒扣在吸水纸上1man,加入5nd的10%预冷甘油重悬细菌沉淀。4℃、5 000r/man离心10man,弃上清液,并倒扣在吸水纸上1man,加入2心的10%预冷甘油重悬细菌分装100ul/Ep,-70℃保存。
 
    (4)电转化:取1ul连接产物与100ul预冷的感受态细菌加入至0.2mm电穿孔杯中进行电转化。电转化仪使用参数:脉冲电压为2 500V,电容为25uF,并行电阻为200Ω。
    次日对每个板上的克隆数目进行计数,选择克隆数/ug最高的连接方案进行连接。
    正式转化时首先将连接产物通过酚/氯仿抽提的方法进行纯化,然后为了避免一个细菌克隆中转入超过一个的DNA克隆,将一个转化反应分散到尽量多的转化体系中进行。
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