DNA重组实验中常用的技术:质粒DNA的提取及鉴定

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一、质粒 DNA的提取及鉴定

(一)质粒DNA的提取及鉴定

1.收获细菌

(1)将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。

(2)将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机 于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。

(3)吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

2.碱裂解法 小量抽提质粒

(1)将细菌沉淀[上述步骤(3)所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA )中，剧烈振荡。

(2)加200μl新配制的溶液Ⅱ(0.2mol/l NaOH, 1%SDS)，缓和振荡，水浴5min。

(3)加150μl预冷溶液Ⅲ(50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml)，缓和振荡，冰浴5min。

(4)4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。

(5)可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，(4)。

(6)用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。

(7)4℃以12000g离心5min。

(8)小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。

(9)用75%乙醇于4℃洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。

(10)加50μl的1×TE(含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶)，振荡，贮存于-20℃。

(二)质粒DNA的大量制备

(1)同上1.(1)

(2)将1ml含菌液倒入含相应抗生素的Lb 100ml中，37℃振荡培养至A590=1.0(5～6h)。

(3)加氯霉素(170μg/ml)扩增，37℃温箱中培养过夜。

(4)收集菌液于离心管中，冰浴10min。3000rpm,离心10min，去上清。

(5)加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min。

(6)加溶液Ⅱ10ml轻轻混匀，室温下5min。

(7)加溶液Ⅲ7.5ml轻轻混匀，冰浴30min。15000rpm，4℃离心20min。

(8)取上清液于高速离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀，入-20℃3～5h。

(9)15000rpm 4℃ 离心20min。

(10)弃上清，将离心管倒放入真空泵中抽干(10～15min)。

(11)用5ml1×TE溶解，加入RNase A 15～20μl，42℃水浴4h于过夜。

(12)加入5ml饱和酚，混匀，4000～5000rpm离心5min，取上清液入5ml离心管内。

(13)分别加入2.5ml饱和酚，2.5ml氯仿，混匀后同样离心收集上清。

(14)加等体积氯仿/异戊醇(24：1)混匀，同样离心收集上清。

(15)加入1/10体积的3mol/l NaAc及2倍体积的无水乙醇于-20℃3～5h。

(16)10000rpm 4℃离心20min。

(17)弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。

(18)离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解质粒DNA。

(三)质粒DNA的鉴定

1.酶切反应

(1)在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。

(2)取反应物点样，观察酶切效果。

(3)酶切完全后，70℃5min终止反应。

2.琼脂 糖电泳

(1)配制所需浓度琼脂糖凝胶。

(2)在待测的DNA样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂，混匀后点样。

(3)打开电源开关，5V/cm电泳。

(4)在UV灯下观察电泳结果。