DNA重组实验中常用的技术(一）

 

一、质粒DNA的提取及鉴定

（一）质粒DNA的提取及鉴定

　　1．收获细菌

　　（1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。

　　（2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。

　　（3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

　　2．碱裂解法小量抽提质粒

　　（1）将细菌沉淀[上述步骤（3）所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris �HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）中，剧烈振荡。

　　（2）加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS），缓和振荡，水浴5min。

　　（3）加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml），缓和振荡，冰浴5min。

　　（4）4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。

　　（5）可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，（4）。

　　（6）用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。

　　（7）4℃以12000g离心5min。

　　（8）小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。

　　（9）用75%乙醇于4℃洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。

　　（10）加50μl的1×TE（含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶），振荡，贮存于-20℃。

　　（二）质粒DNA的大量制备

　　（1）同上1.（1）

　　（2）将1ml含菌液倒入含相应抗生素的Lb 100ml中，37℃振荡培养至A590=1.0(5～6h)。

　　（3）加氯霉素（170μg/ml）扩增，37℃温箱中培养过夜。

　　（4）收集菌液于离心管中，冰浴10min。3000rpm,离心10min，去上清。

　　（5）加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min。

　　（6）加溶液Ⅱ10ml轻轻混匀，室温下5min。

　　（7）加溶液Ⅲ7.5ml轻轻混匀，冰浴30min。15000rpm，4℃离心20min。

　　（8）取上清液于高速离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀，入-20℃3～5h。

　　（9）15000rpm 4℃ 离心20min。

　　（10）弃上清，将离心管倒放入真空泵中抽干（10～15min）。

　　（11）用5ml1×TE溶解，加入RNase A 15～20μl，42℃水浴4h于过夜。

　　（12）加入5ml饱和酚，混匀，4000～5000rpm离心5min，取上清液入5ml离心管内。

　　（13）分别加入2.5ml饱和酚，2.5ml氯仿，混匀后同样离心收集上清。

　　（14）加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀，同样离心收集上清。

　　（15）加入1/10体积的3mol/l NaAc及2倍体积的无水乙醇于-20℃3～5h。

　　（16）10000rpm 4℃离心20min。

　　（17）弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。

　　（18）离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解质粒DNA。

　　（三）质粒DNA的鉴定

　　1．酶切反应

　　（1）在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。

　　（2）取反应物点样，观察酶切效果。

　　（3）酶切完全后，70℃5min终止反应。

　　2．琼脂糖电泳

　　（1）配制所需浓度琼脂糖凝胶。

　　（2）在待测的DNA样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂，混匀后点样。

　　（3）打开电源开关，5V/cm电泳。

　　（4）在UV灯下观察电泳结果。