重组体DNA分子的选择与鉴定

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“选择”(selection)和“筛选”(screening)的基本含义。

选择，是指通过某种外来附加压力(或因素)的辨别作用，呈现具有重组 DNA分子的特定克隆类型的一种方法。选择所涉及的范围较为广泛，包括根据克隆载体提供的表型特征的简单选择(simple selection)，和根据突变的互补作用对克隆基因的直接选择(direct selection)。

筛选则是指通过某种特定的方法，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正具有所需要重组 DNA分子的特定克隆的过程。

一.遗传检测法

(1)根据载体表型特征选择重组 体分子的直接选择法

在基因工程中使用的所有的载体分子，都带有一个可选择遗传标记或表型特征。遗传选择法使我们能够将重组 体的DNA分子同非重组体的亲本载体分子区别开来。

(i)抗药性记号插入失活选择法

pBR322质粒具有编码有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)，只要将转化的细胞培养 在含有四环素或氨苄青霉素的生长培养基中，便可以容易地检测出获得此种质粒的转化子细胞(图6-19)。

(ii)β-半乳糖苷酸显色反应选择法

根据插入失活原理，将外源DNA插入到它的lacZ基因上所造成β-半乳糠苷酶失活效应，可以通过大肠杆菌转化子菌落在Xgal-IPTG培养基中的颜色变化直接观察出来。β-半乳糖苷酶会把乳糖水解成半乳糖和葡萄糖(图6-20)。

(2)根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法

这种选择法依据的基本原理是，转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。

二.物理检测法

(1)凝胶电泳检测法

质粒DNA的电泳迁移率是与其分子量大小成比例的。因此，那些带有外源DNA插入序列的分子量较大的重组体DNA，在凝胶中的迁移速度，就要比不具有外源DNA插入序列的分子量较小的质粒DNA来得缓慢些根据这种差别，就可以容易地鉴定出哪些菌落是含有具外源NDA插入序列的分子量较大的重组质粒。

(2)R-环检测法

在临近双链DNA变性温度下和高浓度(70%)的甲酰胺溶液中，即所谓的形成R-环的条件下，双链的DNA-RNA分子要比双链的DNA-DNA分子更为稳定。因此，将RNA及DNA的混合物置于这种退火条件下，RNA便会同它的双链DNA分子中的互补序列退火形成稳定的DNA-RNA杂交分子，而使被取代的另一链处于单链状态。这种由单链DNA分支和双链DNA-RNA分支形成的“泡状”体，叫做R-环结构。R-环结构一旦形成就十分稳定，而且可以在电子显微锐下观察到(图6-21)。所以，应用R-环检测法，可以鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源的区域。

三.菌落或噬菌斑杂交筛选法

将被筛选的大肠杆菌菌落，从其生长的琼脂平板中小心地转移到铺放在琼脂平板表同的硝酸纤维素滤膜上，而后进行适当的温育。取出已经长有菌落的硝酸纤维素滤膜，使用碱液处理，使 DNA变性。然后再用适当的办法处理滤膜以除去蛋白质，留下的便是同硝酸纤维素滤膜结合的变性DNA。变性DNA同硝酸纤维素滤膜有很强的亲全力，这样便形成了菌落的“DNA印迹”。在80℃下烘烤滤膜，以使DNA牢固地固定下来。将这些滤膜同放射性标记的DNA或RNA探针杂交，并通过放射自显影检测杂交的结果。含有同探针互补的DNA的菌落，在X光底片上呈现黑色的斑点(图6-22)，通过同原培养基平板上菌落位置的对照，挑选出阳性菌落，便是我们所需要的含有目的基因插入片段的重组体克隆。

四.免疫化学检测法

直接的免疫化学检测技术，同菌落杂交技术在程度上是十分类似的。它是用抗体鉴定那引起产生外源DNA编码的抗原的菌落或噬菌斑。只要当一个克隆的目的基因，能够在大肠杆菌寄生细胞中实现表达，合成出外源的蛋白质，就可以采用免疫化学法检测重组体克隆。

免疫化学检测法可分为放射性抗体测定法(radioactive antibody test)，和免疫沉淀测定法(immunoprecipitation test)。这些方法最突出的优点是，它们能够检测不为寄主提供任何可选择的表型特征的克隆基因。