单链高分子质量载体DNA的制备

待转化的酵母菌株
​ DNA (从鲑鱼精巢制备的DNA III型钠盐 Sigma #D1626) l×TE缓冲液 pH 8.0 缓冲液平衡酚 1: 1 (W)酚 氯仿 氯仿 3 mol L 乙酸钠 pH 5.2 100%乙醇 冰冷
超声波发生器

1) 将DNA溶于pH 8.0的1×TE缓冲液，终浓度为10 mg/mL，于4℃搅拌过夜。 因每一次转化需要用200 载体DNA,制备大量的载体DNA Gnig)并于-20℃冻存分装很有用。

2) 用一个大的超声探头，在75%的最大功率下超声处理DNA 30 s，以降低DNA溶液 的黏度。取1 mg DNA在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检查超声剪切后片段大小的分布。如果有必要，可重复超声处理，直到获得适当的片段大小分布：片段大小范围为2〜15 kb,平均大小约为7 kb。

3) 用缓冲液平衡酚抽提1次，酚/氯仿抽提1次，最后用氯仿抽提1次。

4) 加入1/10体积的3 mol/L，pH 5.2的乙酸钠缓冲液，2. 5体积的冰冷100%乙醇沉淀DNA。

5) DNA沉淀用1×TE缓冲液重悬，最终浓度10 mg/mL。重悬沉淀可能需要在4℃搅拌过夜。

6) 将载体DNA移至一个Pyre×耐热玻璃烧瓶中，在微波炉中加热煮沸2〜3　min。

7) 迅速置冰浴中冷却，用无菌试管分装后于-20℃冻存DNA。

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