DNA回收纯化及重组体的构建
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相关基础知识
1.DNA
片段的纯化：
DNA
纯化的主要目的是回收得到纯的
目的
DNA
片段，去除影响
DNA
连接酶活性的物质以及其
它的
DNA
片段。纯化
DNA
片段的方法有多种，如：电洗
脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回收、玻璃珠纯化、
柱层析以及硅胶吸附等方法。目前一些生物公司推出了
直接从
PCR
产物中或琼脂糖凝胶中回收
DNA
片段的试剂
盒，有效地加快了
DNA
的纯化的速度。
2.DNA
重组
DNA
重组本质上是一个酶促生化过程，是指将外源目的
基因片段通过
DNA
连接酶的的作用插入到质粒载体中的
过程。
DNA
片段只有与载体重组并转入合适的宿主细胞
中才能进行复制。通过此方法可以对单个基因的功能进
行研究。结合
PCR
技术还可以应用于疾病诊断、合成具
有商业意义的产品，如胰岛素、干扰素等 。
3.载体的选择
因为载体具有能够在特定宿主细胞中独立自我复制的复
制起始点，保证插入的外源片段的复制；并且具有多个
限制性内切酶的单一位点，即多克隆位点，用于插入外
源片段，而又不破坏质粒本身的结构；还具有易于筛选
和检测的标记性基因，如抗药性基因、酶基因或营养缺
陷型等。但针对不同的研究目，选择的择载体也是不同
的，不仅要考虑上述特性，而且还要考虑所选载体是表
达载体还是非表达载体、是真核生物表达载体还是原核
生物表达载体以及酶切位点等方面的问题。
4.DNA
连接酶
主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
E. coli
DNA 连接酶催化DNA分子连接的机理与T4噬菌体
DNA连接酶基本相同，只是辅助因子不是ATP而是NAD
+
。
T4噬茵体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步。
T4
噬菌体
DNA
连接酶还有一种
E. coli DNA
连接酶没有的特性即将两个平末端的双链
DNA
分子连接起来的功能。对于这种连接反应的机理目前还不清楚，总的来说这种连接的效率比粘性末端的连接效率要低得多，可能是因为平末端
DNA
分子无法形成类似粘性末端分子那样的相对稳定的结构。
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