真核生物mRNA的纯化以及cDNA文库的构建

真核生物mRNA的纯化以及cDNA文库的构建

把带聚腺苷酸的mRNA[(poly(A)+mRNA)经酶促反应转变为双链DNA，进而将此DNA导入原核载体，这一流程已成为真核分子生物学的基本手段。自20世纪70年代中叶首例互补DNA(cDNA)克隆问世以来，业已发展了许多旨在提高双链cDNA合成效率的方法，并大大改进了载体系统。

最初，cDNA的合成与克隆并非易事，但随着理论和技术在广度上的进步，任何一个具一定实力的实验室都可进行cDNA克隆。只要有少量mRNA即可照例建立起一个内容丰富的cDNA文库。由于合成cDNA的酶促反应不断得到改进，克隆长cDNA的方法日趋完善，目前已能分离到与长mRNA相对应的全长cDNA克隆。

cDNA是指以mRNA 为模板，在反转录酶的作用下形成的互补DNA（complementary DNA,简称cDNA）。若再以cDNA为模板，由大肠肝菌DNA聚合酶Ⅰ合成第二链，得到双链DNA。由于制备的mRNA含有某种细胞的各种RNA分子，因而被合成的cDNA产物将是各样mRNA 拷贝的群体，将其和载体DNA 重组，并转化到宿主细菌里或包装成噬菌体颗粒，得到一系列克隆群体。

每个克隆只含一种mRNA 的信息，足够数目克隆的总合则包含细胞全部mRNA的信息,这样的克隆群体叫cDNA库。cDNA便于克隆和大量扩增，不像基因组DNA含有内含子很难表达，可以从cDNA库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。

一.实验原理

构建cDNA库主要包括以下几个步骤：①mRNA的分离；②cDNA的第一链的合成；③cDNA第二链的合成；④cDNA与载体的连接；⑤噬菌体的包装及转染或质粒的转化。

1．mRNA的分离纯化

RNA是一种极易降解的核酸分子，存在于细胞质及核中，提取RNA的方法有很多种,如热酚法、一步抽提法等，或直接用公司提供的试剂盒。总的来说，分离纯化mRNA的过程中始终要注意RNA酶污染的问题，可以使用RNA酶抑制剂加以抑制，例如DEPC(二乙基焦碳酸盐)、酚、氯仿、去污剂、解偶剂、Rnase的特异抑制剂等。

利用高浓度前变性剂异硫氰酸胍可使细胞结构迅速被破坏，使RNA从细胞中释放出来，同时核糖体蛋白也从RNA分子中解离下来，高浓度异硫氰酸胍和β-巯基乙醇还使细胞内的各种RNA酶失活，使释放出来的RNA不被降解。

细胞裂解后存在于裂解液内的有RNA、核DNA、蛋白质和细胞残片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理，离心，使RNA与其它细胞组分分离开来,得到纯化的总RNA。

哺乳动物平均每百万个细胞可含5-10ug RNA 。其中 rRNA占 80%-85%，tRNA占10%-16%，而mRNA仅占1%-5%。 mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一,但绝大多数mRNA分子均在3′端存在20-250个多聚腺苷酸poly(A),利用此特性，用寡聚（ dT）亲和层析柱，很容易从总的RNA中纯化mRNA分子。

2．cDNA的合成

Oligo (dT)纤维素柱分离纯化的mRNA 3′`端都带 poly(A)尾，以oligo(dT)12～18为引物，RNA为模板，就可在逆转录酶的作用下，复制出与mRNA互补的DNA即第一链。因为mRNA混合物中5′端没有共同的特征序列，如果要合成与第一链cDNA互补的第二链cDNA，则不可能利用像oligo(dT)之类的引物而必须借助其它方法。

目前第二链合成采用的引物方式主要有以下四种：

1）利用第一链cDNA的3′`端形成发夹结构为引物自身引导合成互补的DNA链，最后用Dnase S1酶将发夹的单链环切除得到第二链cDNA，并形成双链分子；

2 ）用RNase H1酶将RNA:DNA杂交分子中的RNA 切割成小片断，以这些小片断为引物，用DNA多聚酶合成第二链cDNA，并用DNA连接酶连接各小片断DNA；

3） 用3′端DNA末端转移酶在第一链cDNA 3′末端接上一个人工合成的寡聚核苷酸片断，再用另一个与其互补的人工合成引物与其互补引导DNA 多聚酶1 合成第二链cDNA；

4） 在克隆载体上接有oligo(dT)6

3 .cDNA与载体的连接以及重组λ噬菌体的包装和铺板

第二链cDNA合成后，必须在DNA两端加上带合适酶切位点的接头以供克隆、建库时连接用。接头处要以以下三种方式提供：

1） cDNA用接头上相应限制性内切酶的甲基化酶将酶切位点甲基化，加双链平头接头后酶即制备出带粘性接头的cDNA；

2）cDNA直接加合成的一端为平头的粘性接头即可；3）库载体合成cDNA第二链时即提供引物又提供了接头。通过第一、二链cDNA合成及加接头等步骤，所得的cDNA含有大量的短的合成不完全或降解的DNA片段，必须将它门去除方可保证构建的cDNA文库克隆有效片段及足够大的库容量。通常可以用凝胶过滤（分子筛原理）及低融点琼脂糖凝胶分离纯化两种方 式处理，得到大于500bp以上的cDNA产物。

如果采用质粒DNA作为载体，cDNA与载体连接后可直接转染宿主细胞，建立cDNA库。若采用噬菌体为载体，必须经过体外包装，形成噬菌体颗粒，感染宿主菌。包装蛋白来自大肠杆菌BHB 2690和BHB 2688抽提液。

对于λgt10选用E.coli BNN 102宿主菌，没有外源基因插入的载体在此菌中不能生长。对于λgt11载体则选用E.coli Y 1090为宿主菌，通过蓝白斑确定有无外源基因基因插入。

包装后必须测定噬菌体的效价，只有达到一定的效价，才能大规模地进行包装、转染，一旦cDNA库建立，应进行效价测定并扩增。扩增后的cDNA库克长期保存，并多次筛选。

现将cDNA文库构建的整个过程概括如下：

二. 实验材料与设备

（1） 材料

胚胎组织 载体λgt11 宿主菌 E.coli Y 1090

（2）用品与仪器

高速台式离心机 PCR仪 超静工作台 恒温水浴锅 水浴循环器
恒温培养箱 冰箱（4℃，-20℃） 超低温冰箱（-80℃） 液氮罐
高压蒸汽灭菌锅 稳压点泳仪 紫外分光光度计 快速混匀器
pH计 磁力搅拌器 取液器 研钵 天平
1.5mlEP管 Tip头 烧杯 量筒 培养皿

（3）试剂

0.1%DEPC 水 液氮 mRNA纯化试剂盒 cDNA合成试剂盒
Sephacryl S-400柱 0.5ug/uloligo(dT)15 10mmol/ldNTP
0.1mol/l DTT 大肠杆菌DNA连接酶 M-MLV反转录酶
T4DNA连接酶 T4多核苷酸激酶 20%甘油
α-32P-dCTP Sephadex G-50 LB培养基
SM缓冲液

三. 实验操作程序

（1）用北京华美代理Promega公司的PolyATract ○RmRNA Isolation Systems 从人胚胎组织提取poly(A)+mRNA，具体方法参看产品说明书，紫外分光光度计(Perkin Elmer公司产品)测定其纯度及含量.

（2）用 cDNA合成试剂盒AMV Reverse Transcriptase(Sangon公司)合成cDNA，具体方法参照说明书。

（3） 双链cDNA(dscDNA)合成后加入T4DNA多聚酶，37℃保温10 min，削平双链cDNA的两端， 在cDNA第1,2链的合成过程中均取出一小份反应体系，加入［α-32P］dCTP以示踪cDNA合成的效果.

（4）用T4DNA连接酶将EcoRI人工接头（从公司合成）与削平后的dscDNA连接，方法如下：

按顺序加入各试剂，16℃连接16小时以上。

cDNA 18ul
5×接头缓冲液 10ul
EcoRI接头 12ul
0.1mol/l DTT 7ul
T4DNA ligase(200U/ul) 3ul
用Sephacryl-S400柱去除小于500 bp的cDNA片段及游离的EcoRI人工接头，然后70℃灭活T4DNA ligase10分钟，加3ulT4 polynucleotide kinase (10U/ul),37℃反应30分钟，再70℃灭火10分钟。

（5） T4多核苷酸激酶对连接上cDNA的人工接头磷酸化后,再与去磷酸化的λgt11噬菌体左、右臂相连，连接反应体系如下：

cDNA 100ng
λgt11 1ug
10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 2ul
加水至19ul 混匀，42℃保温15分钟，使λ噬菌体DNA退火，然后冰浴2分钟，加1ul 20UT4噬菌体DNA连接酶（20 000U/ml）,于16℃连接过夜。

（6）从-70℃取出包装蛋白，放在冰浴中融化，待包装蛋白混合物完全融化后，立即加入cDNA进行进行包装， 22℃保温3 h包装成噬菌体，反应完成后加入500ulSM及1滴氯仿，混匀后15000r/min离心2分钟，包装物于4℃保存。混合多份包装产物建成重组λgt11噬菌体文库.

（7） 取出1 μL的包装噬菌体，按1：1000和1：10 000倍稀释后感染对数生长期的E.coli Y1090，铺平板，并在上层培养基中加入终浓度为5 g．L-1的IPTG和11 g．L-1的x-Gal,37℃培养过夜，次日数噬斑数目及蓝、白噬斑之比，计算出文库的大小，对于λgt11，篮斑应少于1/10。

（8）为了验证插入的cDNA片段的平均大小，与构建文库用的同一批cDNA加上EcoRI人工接头后,与经内切酶EcoRI酶切并去磷酸化的质粒载体Bluescript SK相连，并转化感受态细菌TG1，同样铺平板加入IPTG和X-Gal，37℃培养过夜，次日挑出9个白色细菌斑,分别接种入5 mL液体LB培养基中培养,小量提取质粒,并用内切酶EcoRI酶切后,进行琼脂糖凝胶电泳以鉴定切出片段的大小。

（9）对上述构建的的cDNA库进行扩增，取105个噬菌体转染宿主菌E.coli Y 1090，铺板，保温后，加15MLSM,室温振荡2小时，回收SM，4℃5 000r/min离心30分钟，以除去细胞碎片。分装上情，每管1ml，各加20~30ul氯仿，紧塞管于4℃保存。

四. 讨论

成功构建一个cDNA库，mRNA的获得是一个至关重要的因素。首先，mRNA必须完整，mRNA种类越多，构建的cDNA 库就越完整，mRNA不能降解，可用Northern-blot 检测，采用已知基因为探针进行检测，杂交后的条带应清晰，不出现拖尾现象；其次应注意mRNA不被DNA污染，即使是1ppm DNA的污染，也可严重影响其结果。

如果提取出的mRNA降解，可能与以下因素有关：器皿处理不严格、操作方法不严格、样品不新鲜等。所有的RNA专用玻璃器皿都应常规洗净后，应用0.1%的二乙基焦炭酸盐（DEPC）浸泡处理（37℃，2小时），塑料器材使用灭菌的一次性塑料用品，操作者须勤换手套，配制的试剂都用0.1%的DEPC水配，处理过夜后，高压灭菌，所有操作尽可能在冰浴中进行。

cDNA库中有效重组噬菌斑的总数，常称为cDNA文库的容量，表达拷贝数为14个/细胞的基因，从文库中筛选到的机率要达到99%时，cDNA文库的容量一般要达到3.7×106（有效重组噬菌体是指克隆有目的cDNA的噬菌体）。

重组噬菌体中克隆cDNA的的平均大小，以人的组织材料为例，目前估计人的基因表达的mRNA平均大小为2000个碱基，所以它的cDNA文库中克隆的cDNA平均长度要达到1200碱基以上 ，才能认为所构建的文库为可用的文库，通常用实验操作程序中的（8）来检测。