构建病毒cDNA如何选择质粒载体？

用作克隆载体的质粒必须满足如下几方面的条件:(1) 具有复制起点,这是质粒增殖所必不可少的基本条件,可使繁殖的细胞维持 一定的质粒拷贝数。(2)带有抗菌素抗性基因,最好具有两种抗菌素抗性基因,且 抗性基因内有若干单一的酶切位点,便于利用插入失活筛选重组体。(3)具有若 干限制酶单一识别位点,这样可以有选择地供带有不同末端的外源DNA定点插入。(4)较小的分子量和较高的拷贝数,小分子量的质粒易于操作,更能抵抗机械剪切 力的切割,可容纳外源DNA片段也更长(不超过15kb),且可有效地转化给受体细 胞;小分子量的质粒往往属于松弛型质粒,在细胞所拷贝数较高,扩增示回收率高。

第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)

第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。

.1.构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

2.考虑载体的类型：

(1)克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb选质粒。

(2)表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

(3)原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意稀有密码子，糖基化修饰和阅读框错位等问题。

3.载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。由此可以整理选择质粒做为载体的4点要求：

尽量选分子量小的质粒，即小载体（1-1.5kb），这样质粒较稳定，不易损坏，在细菌里面拷贝数也多；

一般使用松弛型控制质粒(relaxed control)，其可自主复制，因此每个宿主细胞10~200个质粒拷贝，此对分子克隆有利。而严谨型质粒(stringent control)，与宿主染色体同步复制，因此每个宿主细胞中只有一个或几个质粒拷贝。

必需具备多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；

必需有易检测的标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验等。