mRNA疫苗，质粒加A尾，怎么构建质粒？

就是基因工程的一部分，获取目的基因，载体。酶切，连接，转化，挑单克隆，验证。

mRNA 3’端的PolyA尾巴结构可通过转录模板的设计添加，也 可在转录后通过酶法进行加尾。PolyA尾巴有助于维持mRNA的稳定 性、运输和转译效率，影响着mRNA的半衰期。

mRNA疫苗的生产流程大致可以分为以下三个阶段：

DNA 原液的制备：质粒 DNA 扩增通常采用大肠杆菌发酵来扩增。从菌 种复苏开始，质粒 DNA 的生产主要经过发酵培养、收获澄清、精制纯 化、线性化、分装储存等步骤。

mRNA 原 液制备 ： 这一阶段主要是通过体外转录技术（ In Vitro Transcription，IVT）以上一阶段的线性 DNA 为模板制备 mRNA。主要 工艺环节包括将线性化质粒 DNA 转录为 mRN、化学修饰（包含 5'端加 帽结构（Cap）和 3'-polyA 加尾结构）、分离纯化、mRNA 原液分装冻 存。

mRNA 制剂制备：关键的制剂技术突破解决了 mRNA 的成药性问题。 mRNA 制剂的主要工艺环节包括 mRNA 的包封/装载、复合物纯化、除 菌过滤、无菌灌装等：其中，包封/装载工艺的基础是递送系统的设计开 发。

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mRNA 疫苗的生产可分为三大阶段，一是 DNA 原液制备，二是 mRNA 原液的制备，三是利用脂质微粒进行包封。

原液制备开始于质粒构建。通常使用的 DNA 质粒为环状质粒，质粒上含有设计好的序列模块。利用电流打破细胞膜，并将环状 DNA 质粒引入大肠杆菌。大肠杆菌被储藏于含有大量营养物质的溶液中进行繁殖扩增。提取并纯化 DNA 质粒，过滤溶液，去除细菌及其他物质。利用酶将纯化后的环状 DNA 质粒切割为链状。将所得溶液分装冷藏，通过质量控制环节，并运送至下一阶段的生产加工场所。