原理
菌落PCR(Colony PCR)可不必提取基因组DNA,不必酶切鉴定,而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增,省时少力。使用载体上的通用引物,进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。
材料与仪器
菌落
溴化乙锭 Taq 延伸 PCR 添加剂 Tween20 10% 溶液dNTP 溶液 PCR 缓冲液 热稳定 DNA 聚合酶 引物
无菌枪头 琼脂糖凝胶电泳设备和试剂
溴化乙锭 Taq 延伸 PCR 添加剂 Tween20 10% 溶液dNTP 溶液 PCR 缓冲液 热稳定 DNA 聚合酶 引物
无菌枪头 琼脂糖凝胶电泳设备和试剂
步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
溴化乙锭
Taq 延伸 PCR 添加剂(Stratagene)
Tween20,10% 溶液
2. 酶和酶缓冲液
dNTP 溶液(包含所有的 4 种 dNTP,每种都是 25 mmol/L)
PCR 缓冲液,10X, 用户买热稳定聚合酶时公司一并提供,或者 PCR 优化缓冲液,比如,Opti-Prime PCR 优化试剂盒(Stratagene),以及 PCR Optimizer(Invitrogen)
热稳定 DNA 聚合酶(5~10U),比如,Taq DNA 聚合酶,克隆化的 Pfu DNA 聚合酶(Stratagene)
3. 核酸和寡核苷酸
可选择:插入物特异的引物(在双向克隆中用来确定插入物的方向)
一套筛选重组体的引物
4. 专用设备
用于划板和接菌的无菌枪头
用枪头代替牙签,是因为牙签可通过毛细作用带走液体,因此会改变反应混合物的浓度。
5. 額外项目
琼脂糖凝胶电泳设备和试剂,包括溴化乙锭
二、方法
1. 根据反应数目或要做的 PCR 反应的管数,在冰上用一个离心管像调鸡尾酒一样准备
PCR「鸡尾酒」式混合物,按如下顺序依次加入各种成分。
H2O 将终体积补充到 25ul
Taq 缓冲液,10X 2.5ul
Tween20(体积分数 10% 溶液) 1.0ul
dNTP 混合物(每种 dNTP 为 25 mmol/L) 0.2ul
重组体筛选引物套(100ng/ul) 1ul
Taq 延伸 PCR 添加剂(5U/ul) 0.25ul
Taq DNA 聚合酶(5U/ul) 0.25ul
2. 在冰上,分装"鸡尾酒"式 PCR 混合物到每一个 PCR 试管中,每管移取 25ul。
3. 对照反应中,加入 1ul 的非重组 DNA。
可以选择:对于用来确定插入方向的反应,向恰当的反应管中加入第三个插入物特异的引物。
4. 对于重组筛选,用一个无菌枪头刺挑一下转化后长出的菌落,然后在相应的反应管中搅动菌落物质。在给每一个反应混合物接种后,迅速地移走枪头,并在含有抗生素平板上轻涂以留菌种,以备后续分析。对于 PCR 介导的重组筛选,也可参考下面的疑难解答。
5. 轻轻混匀每个反应体系。
6. 用推荐的循环参数进行 PCR。
7. 用标准的琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。推荐用 10~15 g/L 琼脂糖凝胶来优化分辨500~6000bp 的 PCR 产物。通常,取 1~5ul PCR 产物经溴化乙锭染色后分析。可以通过传统的瞬间成像技术或计算机图像软件来获取图像。
1. 缓冲液、溶液和试剂
溴化乙锭
Taq 延伸 PCR 添加剂(Stratagene)
Tween20,10% 溶液
2. 酶和酶缓冲液
dNTP 溶液(包含所有的 4 种 dNTP,每种都是 25 mmol/L)
PCR 缓冲液,10X, 用户买热稳定聚合酶时公司一并提供,或者 PCR 优化缓冲液,比如,Opti-Prime PCR 优化试剂盒(Stratagene),以及 PCR Optimizer(Invitrogen)
热稳定 DNA 聚合酶(5~10U),比如,Taq DNA 聚合酶,克隆化的 Pfu DNA 聚合酶(Stratagene)
3. 核酸和寡核苷酸
可选择:插入物特异的引物(在双向克隆中用来确定插入物的方向)
一套筛选重组体的引物
4. 专用设备
用于划板和接菌的无菌枪头
用枪头代替牙签,是因为牙签可通过毛细作用带走液体,因此会改变反应混合物的浓度。
5. 額外项目
琼脂糖凝胶电泳设备和试剂,包括溴化乙锭
二、方法
1. 根据反应数目或要做的 PCR 反应的管数,在冰上用一个离心管像调鸡尾酒一样准备
PCR「鸡尾酒」式混合物,按如下顺序依次加入各种成分。
H2O 将终体积补充到 25ul
Taq 缓冲液,10X 2.5ul
Tween20(体积分数 10% 溶液) 1.0ul
dNTP 混合物(每种 dNTP 为 25 mmol/L) 0.2ul
重组体筛选引物套(100ng/ul) 1ul
Taq 延伸 PCR 添加剂(5U/ul) 0.25ul
Taq DNA 聚合酶(5U/ul) 0.25ul
2. 在冰上,分装"鸡尾酒"式 PCR 混合物到每一个 PCR 试管中,每管移取 25ul。
3. 对照反应中,加入 1ul 的非重组 DNA。
可以选择:对于用来确定插入方向的反应,向恰当的反应管中加入第三个插入物特异的引物。
4. 对于重组筛选,用一个无菌枪头刺挑一下转化后长出的菌落,然后在相应的反应管中搅动菌落物质。在给每一个反应混合物接种后,迅速地移走枪头,并在含有抗生素平板上轻涂以留菌种,以备后续分析。对于 PCR 介导的重组筛选,也可参考下面的疑难解答。
5. 轻轻混匀每个反应体系。
6. 用推荐的循环参数进行 PCR。
7. 用标准的琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。推荐用 10~15 g/L 琼脂糖凝胶来优化分辨500~6000bp 的 PCR 产物。通常,取 1~5ul PCR 产物经溴化乙锭染色后分析。可以通过传统的瞬间成像技术或计算机图像软件来获取图像。
注意事项
1. 设计引物很关键。一般如果是定向克隆,用载体上的通用引物即可;如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆(如单酶切或平末端连接),一条引物用载体,一条引物用目的基因上的,这样就可以比较方便的鉴定了,而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳,同时挑取的菌体不宜太多,否则会有非特异性扩增。
2. 使用的引物浓度不能太高,浓度过高会导致非特异性扩增,反应的循环数也不能太多,一般不超过25个。同时因为扩增的片段的GC含量问题,有的GC含量很低,有的又很高,导致菌落PCR不容易扩增出目的条带,在此建议在设置PCR程序时以高GC的温度为上限,每一循环降0.2度左右。
常见问题
牙签可通过毛细作用带走液体,因此会改变反应混合物的浓度。
来源:丁香实验