1.确保克隆到的基因完全正确：如果这一步出问题，无非两点原因：引物设计不合理，模板质量不高。解决方法：多找几个模板同时进行克隆；重新评估引物的合理性和特异性，比如将引物长度增至40 bp左右。

2.关于酶切酶切其实要求并不十分严格，正常操作下，不论电泳检测是否十分清楚，酶切产物足够连接用量了，没必要纠结。

1.确定你pcr产物正确。

2.酶确实可用

3.实在不行，试试同源重组吧

这个不管是目的基因还是载体，都太长了，肯定不好连，回收的时候保证浓度然后连接时间适当延长试一试