基因与载体的重组（重组体的构建）

目的基因与载体的重组（重组体的构建）程序如下：

（1）质粒DNA 的分离纯化。一般含有单个目的基因的DNA 片段，即使进入了宿主细胞也不能进行增殖。通常它需要同适当的能自我复制的DNA 分子（例如质粒、噬菌体DNA 等）结合后，才能在通过转化或其他途径导入宿主细胞，像正常质粒或病毒一样增殖和易于检测。分离质粒载体DNA 有许多方法，但其共同步骤是先用溶菌酶处理含有质粒载体的宿主菌培养物，以除去其细胞壁，然后加入去污剂（例如SDS），使其发生温和的溶菌作用。

这样质粒DNA 、多聚核糖体、可溶性蛋白质、tRNA 等细胞内的大分子物质便逐步地释放出来，而核染色体的DNA 则仍然附着在细胞的残渣碎片上，经过离心处理，可使其同质粒分开。将离心所得的含有质粒DNA 的上清液，加酚处理除去蛋白。剩下的DNA 混合物中，质粒DNA （cccDNA ）呈超螺旋状态。

为进一步纯化出cccDNA 分子，可在含有溴化乙锭（EB）染料和氯化铯溶液中进行密度梯度离心。EB是一种扁平分子，它能插入双链DNA 分子的两个相邻碱基对之间，从而降低了DNA 分子在氯化铯中的密度。又由于cccDNA 同EB的结合能力比开环DNA 和线性DNA 低得多，这样在氯化绝密度梯度中便可容易地将cccDNA 同其他两种类型的DNA 分离开来其他载体DNA 分高纯化的原理与上述类似。

（2）目的基因与载体的连接。外源DNA 片段与载体DNA 分子的连接，即DNA 分子的体外重组，主要依赖于限制性内切核酸酶及DNA 连接酶的作用。在进行连接时，一般需要注意以下几点：

① 实验步骤尽可能简单容易；

② 在连接后，接点序列能被一定的限制酶重新酶切，以便回收插入片段；

③ 对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。

连接方法一般有两种。一种是用用两种不同的限制酶同时酶解一种特定的DNA 分子，产生具有两种不同末端（粘性末端与另种粘性末端、粘性末端与平齐末端）的DNA 片段，那么可实现外源DNA 片段定向插入载体分子。另一种是非互补粘性末端DNA 分子的连接。即在一定的反应条件下，可用T4 DNA 连接酶将平齐末端的DNA 片段有效地连接起来；对于非互补粘性末端DNA 分子，在用特异作用干单链DNA 的S1核酸酶处理，使其变成平齐末端后，也可用 T4 DNA 连接酶进行有效的连接。

另外，可采用附加衔接物（linker，是一种人工合成的双链DNA 短片段，其上具有一个或数个在将与其连接的载体DNA 上不存在的限制酶识别位点，可按平齐末端连接法给平齐末端片段加上相同识别位点的衔接物，再用在衔接物中具有识别位点的合适限制酶切割，用常规方法连接）的方法，提高平齐末端间的连接作用效率。也可利用接头进行DNA 平齐末端门的连接。接头（adaptor）是一种具有粘性末端的短核昔酸双链，它与平齐末端连接后，不用经过切割即可与载体相连。

为了使连接反应物中尽可能多的外源DNA 片段插入载体分子，以形成重组DNA ，必须阻止在限制酶切割后线性载体分子的自身环化作用。具体可采用以下方法：

（1）用碱性磷酸酶处理限制酶酶解产生的线性载体分子。碱性磷酸酶可除去线性载体DNA 分子的5¹-磷酸，而留下3¹-羟基基团。经过碱性磷酸酶处理的线性载体分子，除非插入外源DNA 片段，否则就不能重新环化为有功能的载体分子。

（2）采用同聚物加尾连接技术，可自动防止线性载体DNA 分子的自身环化作用，这是因为切割后形成的线性DNA 分子的两个3¹-OH末端，此时都已被加上具有同样碱基结构的同聚物尾巴。

（3）应用柯斯质粒，也可防止质粒DNA 分子发生自身环化作用。需要指出的是，在连接反应中，正确配加载体DNA 与外源DNA 间的比例，是高效获得重组体的一个重要因素。在应用λ噬菌体或柯斯质粒作载体时，如果配置高比值的载体DNA /外源DNA 的连接反应体系，就有利于重组体分子的形成；在应用质粒作载体时，因为其重组体分子是由一个载体分子和一个外源DNA 片段环化而成的，所以当载体DNA 与外源DNA 的比例为1时，最有利于重组体分子的形成。