重组载体的构建及鉴定
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重组载体的构建及鉴定
1. 合成 的 ssDNA ，分别命名：编码链为 Forward ssDNA , 模板链为 Reverse ssDNA ， 每1 OD ssDNA 各加33 μl 无菌去离子水溶解，分别取18 μl 进行退火。 在1.5ml Eppendorf管中依次加入以下试剂 10× PCR buffer 4μl Forward ssDNA 18μl Reverse ssDNA 18μl 总体积 40μl 混匀，离心集中样品。 90 ℃ 5min ,缓慢冷却至室温。 2. dsDNA 的双酶切 dsDNA 的 Hind Ⅲ 和 BamH Ⅰ双酶切 1.5ml Eppendorf 管中依次加入以下试剂 10×Tango buffe r 10μl 酶1 1 μl 酶2 1 μl dsDNA 20μl 无菌去离子水 17μl 总体积 50μl （注意： buffe r 的选择要根据你所用的酶1，2来确定，如下表：
2X
BamH1
Hind Ⅲ
混匀，离心集中样品。 37 ℃ 温育过夜，次日，酚氯仿抽提一次， -20 ℃ 无水乙醇沉淀过夜。再次日， 4 ℃ 10000rp m 离心 10min 。 沉淀用 70 ﹪的酒精洗涤一次， 37 ℃ 烘干，加 200μl 无菌去离子水溶解。 3 质粒载体 的双酶切。
1.5ml Eppendorf 管中依次加入以下试剂 R buffer 5μl 酶1 1 μl 酶 Ⅱ 1μl 空质粒 5μl 无菌去离子水 38. 5 μl 总体积 50μl 混匀，离心集中样品。37 ℃ 温育4h，取10 μl 进行1.0 ﹪ 的琼脂糖凝胶电泳。 4 pSUPER.basic 双酶切后大片段凝胶回收 使用BioDev北京博大泰克得 B 型小量 DNA 片段快速胶回收试剂盒，按说明书的步骤回收大片段。 5 双酶切后的 空载体 与 dsDNA 连接。 连接体系如下： 1.5ml Eppendorf 管中依次加入以下试剂
T4 Ligase buffer 1 μl T4 ligase 1 μl dsDNA 1 μl 空质粒 4 μl 无菌去离子水 3 μl 总体积 10 μl 混匀，离心集中样品，16 ℃ 连接过夜。 6 连接产物的转化 5lu双酶切dsDNA加入到100ul 感受态细胞（JM109），冰浴30min，42 0 热休克90s，加入400ul无抗的LB ，37 0 ，150rpm，1h，涂平板。37 0 过夜。 7 质粒提取。 8 PCR鉴定。
注：这些都是我们的工作经验总结，多少次失败后的成功经验，也有好多PCR,双酶切的图片，可惜没有办法上传，如果有什么问题，我们可以交流，QQ27793402，邮箱：yangyang_won@163.com |
