材料与仪器
步骤
构建基于 H V S 的重组载体
材料
试剂
牛 血 清 白 蛋 白(B S A ; 10 % )
细 胞 : E le ctro m ax D H lO B 细 胞(In vitro g e n ); O M K 细胞
氯 霉 素(50ull/m l)
D M E M 补 充 如 下 物 质 :
2 m m o l/ L 谷 氨 酰 胺
0.1 % ( m / V ) 碳 酸 氢 钠
20 0U /m l 青 霉 素
20 0U /m l 链 霉 素
胎 牛 血 清(F B S )
葡 萄 糖(2 0 % 和 4 0 % m / V ) 溶 于 P B S 中
以孔径为0.2um 的滤膜过滤。
P p o l 限 制 酶 和 缓 冲 液(Prom ega) .
卡 那 霉 素(25ul/m l)
Lipofectam ine 2000 (In vitrogen )
L B 培 养 基( p H 7. 5)
1 % ( m/ V ) 蛋 白 胨
0 .5 % (m/V ) 酵 母 提 取 物
0 .5 % (m/v ) 氯化钠
氯 化 镁(l 〇 m m o l/L )
P B S 缓 冲 液
质 粒 : H V S —— B A C 和 pH V S^Shuttle
Q IA q u ic k 凝 胶 回 收 试 剂 盒
病 毒 悬 浮 缓 冲 液
10 0 m m o I/L T ris-H C l (p H 8. 0)
50m m ol/L N A C l
10 m m o l/L E D T A
仪器
Beckm an SW 27 离 心 机
烧 瓶(75 cm 3)
梯度混合器
L B 琼 脂 培 养 平 板(14 cm )
M axiprep 柱(Q IA G E N )
滚瓶
方法
1•将外源基因表达片段(包含合适的启动子、基因片段、多聚腺苷酸化信号)插入到穿梭质粒p H V S ——Shuttle中。
2 . 用 I-P p 0I 酶切,将这个基因的表达框和卡那霉素抗性基因片段从p H V S —— S h u t t le 上分离出来。
I - PpoI 酶切反应是在加入IX B S A 和 1 0 mmol/L MgCl2 的 l X I - PpoI 酶切缓冲液中进行。
3 . 依照产商说明书,用 Q I A q u i c k 凝胶回收试剂盒纯化目的片段。
4 . 用 5〜IOul 的 1-PpoI 酶 切 使 得 H V S ^B A C 线性化。
5.65°C 处理 2 0 m in , 热失活对穿梭质粒和 HVS^BAC 的酶切。
6•将 H V S ^B A C 的酶切产物在蒸馏水(d H 20 ) 中透析 2 h 。
7 . 连接线性化的 H V & B A C 和穿梭质粒片段,标准条件下 16°C 连接过夜。
3 ul 的 H V S ^ B A C 与 I f I 的穿梭质粒酶切片段,在 IO fJ 的连接体系中进行连接,按照这样的比例通常可以得到较好的结果。具体的量可以根据提纯的 D N A 的质量和数量而定。
8 . 将连接产物在蒸馏水(d H 20 ) 中透析 2 h 。
9•用电穿孔法将无盐的连接产物导人到 20ul 的 E lectrom ax D H lO B 菌体中。
10.加人 400W 的 L B 培养液,使菌体复苏。
11.37°C 下,摇 晃(lOOr/m i n ) 孵育 l h 。
12.将电转导后的细胞涂在含有 L B 琼脂培养基、卡 那 霉 素(50ug /m l ) 和氯霉素(25 ug/m l ) 的 平 板 (直 径 M c m ) 上,过夜。
I3•按照产商提供的低拷贝质粒的提取方法,用 M a x i p r e p 柱从形成的菌落中提取和纯化重组的 H V S ^ B A C D N A 。
14.按照产商说明,用 Lipofectamine 2000 将 2 哗 的纯化 H V S —— B A C D N A 转人到 O M K细胞中。
15•将转染后的细胞在 D M E M 培养基中孵育 4〜5d ,直至出现明显的细胞毒性。
16•使子代病毒释放到胞外的培养液中。
病毒工作储存液的生长
最适于 H V S 病毒裂解感染和生长的细胞系是在含有 1 〇% FB S 的 DMEM 培养基中培养的 OMK 细胞。
17•将 I X l O 7 个细胞接种于 75c m 3 的细胞培养瓶中,使细胞生长至汇合。
18.在 5m l 含 有 2 % F B S 的 D M E M 培 养基中,以每个细胞〇.1 个蚀斑形成单位(0•lpfu/cell) 的感染复数感染细胞。
19.在 37°C 感 染 I h 后 ,吸出培养液。
20.加 人 I O m l 含 有 5 % F B S 的 D M E M 培养基,在 37°C 下培养 4〜5d 。
21.当观察到出现细胞毒性时,释放子代病毒到胞外的培养液中。
HVS 的工作储存液可以 2X10s—— 2 X107pfu/ml 的最终浓度,在一 70℃下长期保存。如仅需中期保存, HVS 能在 4°C 保持稳定。
高滴度病毒的生长和纯化
22.将 约 2 X 108个 O M K 细胞接种于滚瓶中,用含有 10% F B S 的 D M E M 培养基培养。
23•以约 0.5pfu/个细胞的感染复数感染细胞。孵育 4〜5d 。
24•分离细胞,收集细胞培养液。
25.用带 BeckmanSW27 转头的离心机, 4°C 下 ,将悬浮液于 20 000r/m in 离 心 90 min。
26•用病毒重悬缓冲液将沉淀重悬,每两个转瓶约使用 3m l 的重悬缓冲液。 4°C 下过夜。
27.用梯度混合器,准 备 2 0 % 〜4 0 % 的葡萄糖浓度梯度。在浓度梯度中使重悬的病毒分层。
28•用带 Beckman SW27 转头的离心机, 4°C 下 ,于 20 OOOr/m in 离 心 30 min 。
29•收获中间的条带,这条带中包含约 9 0 % 的包装的病毒颗粒。
30•用带 Beckman SW27 转头的离心机, 4°C 下,于 25 OOOr/m in 离心 60 min。用 PBS 重悬沉淀。
来源:丁香实验