用 表 达 HVS-GFP 的 H V S 病毒重组体检测 H V S 的感染效率

用 表 达 HVS-GFP 的 H V S 病毒重组体检测 H V S 的感染效率

材料

试剂

1.细胞：目的细胞株

2.DMEM 培 养 基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium)

3•胎牛血清（F B S )

4•潮霉素（250fil/m l ; Invitrogen) <C !〉

5.病毒： H V & G F P

仪器

培 养 皿（35m m )

荧光显微镜

方法

1 . 用 H V & G F P 感染目的细胞株。感染贴壁的单层细胞

a•将 5X 10⁵ 个目的细胞接种于 35m m 的培养皿，使其生长至 8 0 % 的汇合度。

b. 在 0. 5m l 含 有 2 % F B S 的 D M E M 培养基中，以 1 倍的感染复数感染细胞。

c. 37°C 感染 l h 。

d. 吸出培养液，换为含有 1 0% F B S 的 D M E M 培养基。 37°C 下孵育。

e•感染 24 h 之后，在荧光显微镜下检测感染率。

感染悬浮的细胞

a•在 0. 5m l 含有 2 % F B S 的 D M E M 培养基中，将 2 X 1 0 ⁵ 个细胞与 10 倍感染复数的 H V S - G F P 混合。

应用离心法可以得到对悬浮细胞的高效感染。

b.20°C 下， 1500r/m i n 离心悬浮液，促进细胞对病毒的吸收。

c . 以含有 10 % F B S 的 D M E M 培养基清洗细胞。

d•用 2m l 的 D M E M 培养基重悬沉淀， 37°C 下孵育。

e. 感 染 24 h 之后，在荧光显微镜下检测感染效率。

获 得 H V S 稳定感染的细胞系

基 于 H V S 的载体的主要优点之一在于它可以在分裂的细胞群中以游离的附加体形式 稳定存在（Hall et al.20 〇 3; W h i t e et al.2003)。

2.重复上述的单层和悬浮感染步骤，以建立稳定的长期感染的细胞株。

3•感染 24 h 之后，在培养基中加人 250ul / m l 的潮霉素，培 养 2 周。其 间 每 4d 更换培养基和潮霉素。

经 过 2 周的培养，只有那些被成功转导了的细胞可以存活下来。

4•在荧光显微镜下检测稳定转导细胞系的效率，应 该 1 0 0 % 的细胞都可以表达绿色荧光蛋 白