肝中RNA的分离与鉴定

原理

细胞内的核酸多以核蛋白的形式存在，其中脱氧核糖核蛋白主要存在于细胞核中，核糖核蛋白主要存在于细胞质中。这两类核蛋白在0.14mol／L氯化钠溶液中的溶解度相差很大。核糖核蛋白在此溶液中具有很高的溶解度、脱氧核糖核蛋白的溶解度却相当低。

制成肝匀浆后，用0.14mol／L氯化钠溶液抽提，可将两种核蛋白分离。分离过程中加入少量柠檬酸钠，可抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的水解作用。

在含有核糖核蛋白的0.14mol／L氯化钠溶液中，调节pH至4.2，使其达到等点电，核糖核蛋白即从溶液中沉淀出；用热的10％氯化钠溶液抽提核糖核酸，最后用冷乙醇将核糖核酸钠析出，而获得纯化的RNA。

DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值，蛋白质则在280nm处有很高的吸收峰值。利用这个原理，我们测定纯化样品在260nm和280nm处的吸光度，可以推算出样品中RNA的浓度，并判断其纯度。

用标准样品测得在波长260nm处，1µg/ml RNA钠盐吸光度为0.025，（光程为1cm），即A260＝1时，样品中RNA浓度为40 µg/ml。纯净的RNA样品A260/A280的比值约为2.0，样品中含有蛋白质或其它杂质，会使A260/A280的比值下降。A260/A280的比值大于1.8基本能达到各种后继实验的要求。

操作

1．肝匀浆制备：新鲜兔肝，用0.9％NaCl洗去血液，除去结缔组织，剪碎，称取4g肝组织，加4m1 0.14mol/L NaCl溶液，匀浆器中研磨，制成肝匀浆。

2．分离核蛋白：肝匀浆倒入试管中，4000rpm离心5min，上清倒入另一试管中为A管。沉淀加2m1 0.14mol／L NaCl搅匀后再置匀浆器中研磨，4000rpm离心5min，上清倒入A管，沉淀重复上述操作，上清并入A管，沉淀弃去。

3．A管用10％乙酸调pH至4.2，混匀，静置5min，4000rpm离心5min，倾去上清，沉淀含核糖核蛋白。

4．A管沉淀中加3m1 10％NaCl，搅匀，100℃水浴10min(不断搅拌，防沸溢出)，冷却， 4000rpm离心5min，留上清液。

5．A管上清液加95％冷乙醇5ml，见乳白色核糖核酸钠沉淀，混匀放置10min，4000rpm离心15min，沉淀为纯化RNA。

6．RNA的溶解：沉淀中加入0.1 mol/L NaOH 4.0ml，搅拌溶解，2000rpm离心10min，上清液则为RNA水解液。

7．RNA的测定：用0.1mol/L NaOH 将样品稀释到一定浓度，以0.1mol/L NaOH 调零，测定样品的A260和A280，计算出每克肝组织中的RNA含量，并判断纯化RNA的纯度。

注意事项

1. 在制备肝匀浆时，应尽量在冰冷条件下进行。

2. 各步骤操作应力求准确，尽量减少中途核酸的丢失，保证定量测定的准确性。

3. 稀释后应该尽量使样品A260和A280处于0.1-0.7的范围内。

仪器

玻璃匀浆器
离心机
UV9100紫外可见分光光度计
试管
刻度吸管

试剂

1. 0.9％氯化钠溶液。
2. 10％氯化钠溶液。
3. 0.14mol／L氯化钠溶液(含0.01 mol／L柠檬酸钠)：称取氯化钠 8.182g和柠檬酸钠-2H2O 2.941g，用蒸馏水溶解并稀释至1000m1。
4. 10％乙酸溶液。
5. 95％乙醇溶液(冷藏)
6. 0.1mol/L NaOH