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肝中RNA的分离与鉴定

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原理

细胞内的核酸多以核蛋白的形式存在,其中脱氧核糖核蛋白主要存在于细胞核中,核糖核蛋白主要存在于细胞质中。这两类核蛋白在0.14mol/L氯化钠溶液中的溶解度相差很大。核糖核蛋白在此溶液中具有很高的溶解度、脱氧核糖核蛋白的溶解度却相当低。

制成肝匀浆后,用0.14mol/L氯化钠溶液抽提,可将两种核蛋白分离。分离过程中加入少量柠檬酸钠,可抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的水解作用。

在含有核糖核蛋白的0.14mol/L氯化钠溶液中,调节pH至4.2,使其达到等点电,核糖核蛋白即从溶液中沉淀出;用热的10%氯化钠溶液抽提核糖核酸,最后用冷乙醇将核糖核酸钠析出,而获得纯化的RNA。

DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值,蛋白质则在280nm处有很高的吸收峰值。利用这个原理,我们测定纯化样品在260nm和280nm处的吸光度,可以推算出样品中RNA的浓度,并判断其纯度。

用标准样品测得在波长260nm处,1µg/ml RNA钠盐吸光度为0.025,(光程为1cm),即A260=1时,样品中RNA浓度为40 µg/ml。纯净的RNA样品A260/A280的比值约为2.0,样品中含有蛋白质或其它杂质,会使A260/A280的比值下降。A260/A280的比值大于1.8基本能达到各种后继实验的要求。

操作

1.肝匀浆制备:新鲜兔肝,用0.9%NaCl洗去血液,除去结缔组织,剪碎,称取4g肝组织,加4m1 0.14mol/L NaCl溶液,匀浆器中研磨,制成肝匀浆。

2.分离核蛋白:肝匀浆倒入试管中,4000rpm离心5min,上清倒入另一试管中为A管。沉淀加2m1 0.14mol/L NaCl搅匀后再置匀浆器中研磨,4000rpm离心5min,上清倒入A管,沉淀重复上述操作,上清并入A管,沉淀弃去。

3.A管用10%乙酸调pH至4.2,混匀,静置5min,4000rpm离心5min,倾去上清,沉淀含核糖核蛋白。

4.A管沉淀中加3m1 10%NaCl,搅匀,100℃水浴10min(不断搅拌,防沸溢出),冷却, 4000rpm离心5min,留上清液。

5.A管上清液加95%冷乙醇5ml,见乳白色核糖核酸钠沉淀,混匀放置10min,4000rpm离心15min,沉淀为纯化RNA。

6.RNA的溶解:沉淀中加入0.1 mol/L NaOH 4.0ml,搅拌溶解,2000rpm离心10min,上清液则为RNA水解液。

7.RNA的测定:用0.1mol/L NaOH 将样品稀释到一定浓度,以0.1mol/L NaOH 调零,测定样品的A260和A280,计算出每克肝组织中的RNA含量,并判断纯化RNA的纯度。

注意事项

1. 在制备肝匀浆时,应尽量在冰冷条件下进行。

2. 各步骤操作应力求准确,尽量减少中途核酸的丢失,保证定量测定的准确性。

3. 稀释后应该尽量使样品A260和A280处于0.1-0.7的范围内。

仪器

玻璃匀浆器
离心机
UV9100紫外可见分光光度计
试管
刻度吸管

试剂

1. 0.9%氯化钠溶液。
2. 10%氯化钠溶液。
3. 0.14mol/L氯化钠溶液(含0.01 mol/L柠檬酸钠):称取氯化钠 8.182g和柠檬酸钠-2H2O 2.941g,用蒸馏水溶解并稀释至1000m1。
4. 10%乙酸溶液。
5. 95%乙醇溶液(冷藏)
6. 0.1mol/L NaOH

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