​ 附加方案：去垢剂提取物中RNA的分离

应用异硫氰酸胍/苯酚/氯仿的方法可从去垢剂提取物中分离总RNA。<link />

①每1倍体积的去垢剂提取物中加入3倍体积的RNA提取缓冲液，反复倾晃4次

以使蛋白变性。

②每一个样品中加入：

0.1倍体积的2mol/L醋酸钠（PH4.0)

1倍体积的水饱和苯酚

0.2倍体积的氯仿

每加入一种组分就剧烈混匀。把样品置于冰上，静置15min。

③离心样品，10000g，20min。

④用吸管小心地将上层的水相转移到另一干净的小管中。加人等体积的异丙醇，颠倒小管以混匀样品。把小管存放在-20℃过夜，沉淀RNA。

⑤次日，离心样品，10000g，15min。

⑥小心地除去上清，并翻转小管，排尽液滴。

⑦用1ml75%乙醇洗RNA沉淀，然后将其转移至干净的1.5ml的离心管中。100000g离心10min。

⑧在离心真空干燥机上干燥RNA沉淀5min。

⑨用30〜50μL的0.1%SDS溶液（含有1mlEDTA)重悬RNA，65℃水浴加热样品10min.

⑩在微型离心机上离心2min.以澄清溶液。

⑪转移澄清的上清液至另一个试管中。为了定量和鉴定纯度，将一管RNA溶液稀释250倍（如4μLRNA中加入996jbtl水），并测出在260nm和280nm处的吸光值。A260/A280的比值一般为1.45士0.15。

利用DDF分离RNA的结果

①通过DDF分离的总RNA的产量（每个100mm培养瓶的RNA的质量，为459mg±18mg)—般比对照的RNA(289mg±42.5mg)高。对照RNA是通过直接在未经组分分离的细胞上加入异硫氰酸胍所做的平行实验。

②对于成骨细胞，毛地黄皂苷/EDTA提取物中的RNA占胞内总RNA的约17%，Triton提取物中约为29%，而核/抗去垢剂组分约为54%。

③从DDF提取物上制备的RNA可以很容易地在琼脂糖甲醛凝胶上进行分离（见图3.4)，并可用标准方法进行Northern杂交。用这种方法，可以观察到完整mRNA的清晰条带，并且可以通过比较不同组分中mRNA的差异找出细胞不同阶段或不同处理所致的mRNA区域特异分布的变化。

④在胞质提取物中富含tRNA,在核/细胞骨架组分中富含rRNA。与对特定亚细胞区域的选择性分离的结果一致（见图3.4)。

⑤不同阶段和不同处理的DDF组分中特定mRNA的分布不同，这表明使用DDF分离RNA为平行观察蛋白分析过程中mRNA的定位和移动(trafficking)提供了一个新的方法。

<link />

要点提示：玻璃器皿和试剂的准备要格外小心，避免因RNA酶的污染引起RNA降解；烘烤所有玻璃器皿4h以上（300℃),这些器皿只用于RNA分离过程；用超纯水C用DEPC处理，并高压灭菌）配制RNA缓冲液/溶液；样品要冰浴；用无菌的细胞培养用的10ml塑料吸管吸取样品，取2.0ml去垢剂提取物，该体积有利于分离RNA的操作，其样品含量足够蛋白质和RNA分析所用，包括Northern杂交；一般，3倍体积的GIT缓冲液1倍体积的去垢剂提取物是分离完整RNA所需的最小比例，比例再小会引起RNA的降解。<link />

<link />