丁香实验_LOGO丁香通
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
收藏
wx-share
分享

真核细胞结构组分的差异去垢剂分离实验

实验分类:

蛋白质实验

最新修订时间:

简介

来源:《蛋白质与蛋白质组学实验指南》

 

来源:丁香实验

操作方法

基本方案

细胞制备①在冰上预冷细胞培养物,然后用冰浴的盐溶液、PBS或其他的非变性缓冲液洗2〜3次。保存1份洗涤缓冲液(贮存在-70℃)以备将来进行样品校正,或用于酶、蛋白或RNA分析的对照材料。②选择下面合适的方法来处理悬浮液或单层培养物。处理悬浮培养物:悬浮培养的细胞所需的DDF体积取决于细胞的湿重或细胞数量。a.转移一小管悬浮培养物到已称重的塑料小管中,然后短暂地离心;b.倒出培养基,并称出细胞沉淀的

​ 附加方案:去垢剂提取物中RNA的分离

①每1倍体积的去垢剂提取物中加入3倍体积的RNA提取缓冲液,反复倾晃4次以使蛋白变性。②每一个样品中加入:0.1倍体积的2mol/L醋酸钠(PH4.0)1倍体积的水饱和苯酚0.2倍体积的氯仿每加入一种组分就剧烈混匀。把样品置于冰上,静置15min。③离心样品,10000g,20min。④用吸管小心地将上层的水相转移到另一干净的小管中。加人等体积的异丙醇,颠倒小管以混匀样品。把小管存放在-20℃过夜

​附加方案:用镁沉淀微管蛋白和微管结合蛋白

① 加入0.1mol/L MgCl2,将一管毛地黄皂苷/EDTA提取物(主方案中的CYTO组分)的Mg2+含量调至7〜35mmol/L。37℃孵育样品20〜30min。所使用的毛地黄皂苷/EDTA提取物的体积取决于实验目的。镁的终浓度取决于最初材料的来源。通常,35mmol/L的镁是过多的,多用于以完全回收蛋白为目的的实验。②离心8min沉淀微管蛋白和微管结合蛋白。③转移上清液至一干净的小管中。用

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序