胚胎小鼠纹状体神经干细胞的分离培养及鉴定

材料

1、实验动物

孕13d的昆明种二级小鼠。

2、主要试剂

主要试剂 来源

DMEM/F12 GIBCO

rh-EGF peprotech

rh-bFGF peprotech

B-27 supplement GIBCO

HEPES Sigma

Trypsin Sigma

Ploy-L-lysine Sigma

胎牛血清（FBS） 杭州四季青公司

青霉素 华美

链霉素 华美

胰酶阻断剂（STI） GIBCO

葡萄糖 药剂科制剂室

台盼蓝 西安化学试剂厂

蔗糖 西安化学试剂厂

酚红 西安化学试剂厂

KH2PO4 西安化学试剂厂

Na2HPO4.12H2O 西安化学试剂厂

NaCL 西安化学试剂厂

KCL 西安化学试剂厂

抗-nestin mab chemicon

抗-βtubulin mab chemicon

抗- GFAP pab neomarker

抗- GalC mab chemicon

FITC 偶联荧光抗小鼠二抗 博士德

3、主要仪器

解剖剪 上海医疗仪器厂

虹膜剪 上海医疗仪器厂

眼科剪 上海医疗仪器厂

离心机 上海医疗仪器厂

自动双重纯水蒸馏器 教保处

微孔滤膜滤器 教保处

MCO-17AC CO2 培养箱 SANYO

XTD-10A体视显微镜 芜湖光学仪器厂

无菌超净工作台 苏州净化设备厂

50ml 细胞培养瓶 NUNC

96孔细胞培养板 NUNC

24孔细胞培养板 NUNC

6 孔细胞培养板 NUNC

倒置显微镜 Leica

OLYMPUS荧光显微镜 OLYMPUS

OLYMPUS光学显微镜 OLYMPUS

方法：

神经干细胞的培养

①原代细胞的培养：取孕13.5天昆明种二级孕小鼠，引臼脱颈处死,碘酒、乙醇消毒腹部,逐层剖开腹部皮肤、肌肉、腹膜，取出子宫,放入盛有D1-SGH液的器皿中。仔细剥离胎膜、羊膜，暴露胎鼠，剪开颅骨，取出胎鼠脑组织并转移至另一盛有D1-SGH液的器皿中，体视显微镜下剥离脑膜,分离胎鼠纹状体，仔细剥离血管及脑膜，将收集到的纹状体在D-hanks液中漂洗两次，置于盛有4℃D-hanks液的器皿中，用虹膜剪将组织剪碎,加入0.125℅的胰酶消化(37℃，15min)，期间每隔5min震荡一次。500转离心5min, 弃上清，D-hanks液清洗两次，将沉淀细胞重悬于增殖培养基中，培养基成分：DMEM/F12（1：1），2% B27 supplement，青霉素、链霉素各100U/ml，EGF 20 ng/mL，b-FGF 10ng/mL。用火焰抛光的吸管反复吹打，分散组织制成单细胞悬液，吸取9滴细胞悬液、1滴0.4℅台盼蓝溶液混合，用血细胞计数板在3分钟内计数出活细胞和死细胞（台盼蓝排斥法），调整细胞密度，以105个/ mL接种75mL培养瓶中（NUNC）, 于5℅CO2 培养箱, 37℃培养。期间倒置显微镜下观察细胞的生长状况。

②传代培养：当神经球直径大约100um时收集细胞于离心管中，600转离心5分钟，弃上清，加入无血清培养基重悬细胞，吸管轻轻吹打细胞，使之形成单细胞悬液，计数后以104个/ mL接种75mL培养瓶中，于5℅CO2 培养箱, 37℃培养，完成一次传代。此后每隔两天半量换液，5-7天机械分离细胞传代1次。期间倒置显微镜下观察细胞的生长状况。胚胎小鼠纹状体神经干细胞的分离培养及鉴定。