脐血来源胚胎样干细胞的分离

(a)分离和制备CB-MNCs。

(b)根据以下免疫磁珠分选的方法纯化原始系限制性干细胞。

(c)用2%HAG处理MNCs，4℃放置20 min。

(d)用小鼠抗人CD45,CD33，CD37和抗血型糖蛋白A单克隆抗体标记MNCs，4℃标记30 min。

(e)用ACD-A缓冲液洗细胞，400g，4℃离心10 min。

(f)用ACD-A缓冲液再洗一遍。

(g)用磁珠标记的人IgG4抗总小鼠IgG单克隆抗体标记MNCs 30 min。

(h)根据产品说明书用磁分离器分离系特异性分子阴性（Lin-)的细胞群体。

(i)按以下步骤安装细胞分离装置和硅酮管：用70%乙醇灌洗10min。用水洗两遍，每次5 min。用5%BSA/PBSA润洗。用弹簧夹夹住硅酮管的下段，用带子将硅酮管安全地固定在磁分离器中。

(j)分离细胞前，用培养基加满细胞分离装置中的硅酮管，使通过柱子的流速控制在5mL/min以内。然后，用微量吸管将细胞/磁珠混合悬液加到管中，刚好低于液体的弯月面。

(k)用巴氏吸管，不断添加培养基，防止管上的细胞脱水。

(l)用15mL离心管收集流出的部分（含没有结合磁珠的细胞，Lin-细胞）。

(m)用台盼蓝染色进行活细胞计数。

(n)用含TPOFLK细胞因子混合物的培养基将UCB来源的Lin细胞接种到没有包被过的6孔培养板中，接种浓度为2.7×10⁴个细胞/mL。

(o)将细胞在37℃,5% CO₂的条件下培养，每周一次更换培养基和细胞因子。

(P)必要时，用0.05%胰蛋白酶/EDTA消化贴壁细胞，按1×10⁵个细胞/mL浓度接种到新培养瓶中，按上述条件继续培养细胞。