脐血MSCs的分离 培养 纯化 扩增

从2000年Erice A 最先提出脐血MSCs后，脐血MSCs的研究迅速成为继骨髓MSCs之后的又一热点。但是，由于脐血中MSCs数量非常少，给培养造成了很大困难，四分之 一能分离培养出MSCs已经很不错了。有文献甚至说足月胎儿脐血中没有MSCs。目前，维普上的文章很多都不可信，国外文献相对更具参考价值。

针对于UCB—MSCs的贴壁时间和形成细胞克隆的时间较晚 ，将首次换液

时间往后移至第5天；传代时间确定在种板后的第21天左右；

正常足月产胎儿的脐血，在低糖DMEM 10% 血清的条件下一从MNC可以培养出MSC．但其Msc的建立时间较长、频率低是其主要特点 。

大部分脐血MNC培养5～7 d后可形成贴壁细胞，有类纤维样细胞、扁平圆形细胞等两类细胞，但随着时间的延长，这些细胞不能增殖，胰酶难以消化，不能进行传代。小部分脐血培养2周左 右出现MSC，且数量少，经30 d左右长满瓶底。传代到第3代后，这类细胞为均一的长梭形细胞。

不同的分离方法、接种密度、首次换液时间、不同的培养基对脐血中的间充质干细胞原代培养过程 影响很大

在其他条件不变的情况下, 羟乙基淀粉沉淀法优于Ficoll分离法, 107/ cm2 是脐血MSC培养的适宜接种密度, 首次换液时间为7 d。

淋巴细胞分层液法

无菌条件下采集健康胎儿脐带血50～100 mL, 肝素抗凝, PBS 1∶1稀释, 缓缓加到Ficoll 分层液上(质量浓度1.077 g/L) ,2000r/min离心25min,取中间界面白膜层, PBS洗涤2次, 制成单细胞悬液,接种.

羟乙基淀粉沉淀法

脐血与6%的羟乙基淀粉按照5∶1的比例混匀, 室温下静置30min~1 h, 取上清, 2000r/min离心10 min, 弃上清,PBS洗涤2次, , 接种于T25培养瓶中, 置于37℃, 5%CO2 饱和湿度的孵箱中培养。

对于脐血有核细胞的分离, 文献报道多用Ficoll分离, 此种方法的优点在于分离的细胞较均一, 却容易损失很多细胞, 由于脐血中的MSC所占比例极少, 应尽可能保留, 应用了羟乙基淀粉沉淀法, 减少体外处理步骤, 减轻处理过程中对细胞的损伤, 在分离的细胞总数量、原代培养时间方面均优于Ficoll分离法。

根据我们的经验在培养过程中需注意几点:

1 接种密度要足够高。

2 培养基要偏酸性, 抑制其他造血细胞的生长。

3 通过传代可以逐渐达到纯化的目的, 在传2代后, 细胞纯度多可以达到95%以上, 有条件可以应用间充质专用培养基。

4 首次换液时间7 d

脐血中MSCs比例低；UCB—MSCs体外培养影响因素相对复杂，如随着孕龄增长，脐血中的MSCs大部分定位于脐带静脉内皮下层和胎盘基质，而外周循 环很少 ，这可能是导致足月儿脐血MSCs难以收获的原因所在；通常采用的密度梯度离心法所获得的脐血单个核细胞中混杂有大量的各种血细胞成分，影响精确计数，致 实际的接种密度偏小；随后再次筛选的MSCs的贴壁法，一方面由于杂细胞的影响，不能保证所有的细胞充分附着，另一方面对附着于底面的细胞不具特异的选择 性，不排除其他贴壁细胞混杂其中的可能.

脐血MNCs数值的多少与采集量密切相关，而相同采集量的脐血中的MNCs数量与胎龄呈负相关，即胎龄越小，单位体积内的MNCs数越多。这可能是文献中认为早产儿脐血MSCs培养容易成功的主要原因之一。

离心分层法分离脐血MNC培养后，有两种细胞出现:间充质样细胞和破骨样细胞。破骨样细胞胞体较大，呈圆形或椭圆形，多个核。间充质样细胞单个核，胞体呈 梭形，最初多散在存在，亦有少量积聚存在，约2到3周后形成较为单一的细胞克隆，随着细胞的迅速增殖，3周后细胞生长达80%融合，每个克隆约几百至几千 个细胞，此时的脐血MSCs呈较均一的长梭形，形态类似于成纤维细胞。细胞长到80%融合时，用1: 1的胰蛋白酶和 EDTA混合液消化，将这些细胞以1.0x 104/cm密度接种于传代培养瓶中进行传代培养。传代后的HUCBMSCs 10 }14 d左右达融合，可继续传代扩增。

据统计约有30%的脐血样本MNC培养后出现MSC, 70%的脐血样本MNC培养后出现破骨样细胞，破骨样细胞呈卵圆形，多个核，难以消化、传代，随着培养时间的延长，贴壁细胞形态出现多样性变化，形态上与文献报道的破骨细胞或巨噬细胞类似。