植物基因组DNA的分离纯化及RAPD扩增

1、植物基因组DNA的分离纯化
一、实验原理
核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA是双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子，有些噬菌体DNA有时为单链环状分子。95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。
从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。
盐溶法是提取DNA的常规技术之一。在制备核酸时，通常是用研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。利用DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液而RNA能溶于0.14mol/L 的NaCl溶液这一性质可以将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品破碎细胞液中分开。
分离得到核蛋白后，还需进一步将蛋白等杂质除去。去除蛋白的方法有 3种：① 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除 去变性蛋白质。用这种方法处理时，蛋白质停留在水相和氯仿相中间，而 DNA则溶于上层水相，用两倍体积95%乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。② 用 十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，从而使其与核酸分离，也可 从材料中直接提取出DNA。③ 用苯酚处理，然后离心分层，一样可以将DNA 与蛋白质分离开来。这时DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内， 吸出上层水相，加入两倍体积的95%乙醇即可得到白色纤维状DNA沉淀。反复 使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去， 得到较纯的DNA制品。本实验采用CTAB法从植物幼苗中提取基因组DNA。
为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA杂质，可用RNA酶进行处理。另外， 生物材料中还含有大量的脂肪物质和多糖，这些物质在用盐溶液分离核蛋白 和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可被除去。
核酸纯化目标：纯化后的核酸样品中不应该存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的重金属离子；其它生物大分子物质如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；排除RNA分子污染。
操作注意事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程减少各种有害因素对核酸的破坏；减少化学因素对核酸的降解，一般pH4-10；减少物理因素如机械切力、高温对核酸的降解。
提取步骤：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质、多糖和脂类分子，去除RNA，去除盐类、有机溶剂等杂质。方案：视具体的生物材料和待提取的核酸分子特点而定。

二、仪器设备
高速离心机、水浴锅、电子天平、冰箱

三、材料及试剂
1. 材料：水稻幼苗
2. 试剂：
① 2×CTAB提取液(内含2%CTAB、1.4mol/L NaCl、25mmol/L EDTA、0.2%%26#61538;-巯基乙醇和0.1mol/LTris-HCl，pH8.0)：取2g CTAB、8.18g NaCl、0.74g EDTA-Na2.2H2O，加入10ml 1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)和0.2ml%26#61538;-巯基乙醇，加双蒸水(ddH2O)定容到100ml；
② 氯仿:异戊醇(24:1)
③ 洗涤缓冲液(70%乙醇，内含10mmol/L乙酸铵)：取70mL无水乙醇和0.077g乙酸铵，加双蒸水定容到100ml；
④ 无水乙醇、70%乙醇；
⑤ TE缓冲液：内含10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH8.0

四、操作步骤
① 取水稻幼苗，液氮研磨成粉，迅速分装于Eppendorf 管中，加入0.7ml 60℃水浴中预热的2×CTAB提取液和20ul b -巯基乙醇，轻轻转动使之混匀；
②　样品于60℃温浴45min，每5min将Eppendorf管上下颠倒混匀；
③　加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀，室温下放置5min，6000g离心10min。
④　上层溶液转入另一个干净Eppendorf 管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，混匀，６000g转离心5min；
⑤　重复步骤④ 2-3次，直至无白色界面物质 ；
⑥　将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入2/3体积的预冷异丙醇，轻轻混匀使核酸沉淀下来。在-20℃下放置30min，4℃、10000g转离心10min，弃上清液；
⑦　沉淀用加入1ml洗涤缓冲液，10000g离心1-2min；
⑧　沉淀用无水乙醇洗1次， 10000g离心1-2min；
⑨　沉淀置于空气中3-5min，晾干后加入15-20 ul无菌水溶解；DNA含量测定及电泳检测，琼脂糖浓度为0.8%。
取2-5ulDNA溶液稀释至100ul，于紫外核酸蛋白检测仪上测定A260、A280和A320的OD值，并计算DNA浓度和得率。
注：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm，在波长260nm紫外线下，1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1个OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ml，单链DNA或RNA为40ug /ml，单链寡核苷酸为20ug/ml。纯的DNA的A260/A280在1.8左右。

2、RAPD技术在生产上的应用-杂交水稻种子纯度的鉴定(RAPD 扩增)
一、实验原理
传统的种子纯度鉴定主要有田间鉴定法和实验室鉴定法。实验室鉴定种子纯度主要依据种子的物理、化学及生理特性等。但随着生物化学及分子生物学技术的迅速发展，种子纯度鉴定技术产生了质的飞跃，现代生物化学和分子生物学技术被成功地引入到种子纯度的鉴定中，如蛋白质电泳和分子标记等。
分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的遗传标记。广义的分子标记包括同工酶标记和DNA标记，狭义的分子标记仅指DNA标记。DNA标记主要有：
1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism 即限制性片断长度多态性)。它是由于核酸序列不同而造成的DNA限制性片断之间产生等位基因差异的结果。
2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)。
3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段的长度多态性)。
4.SAP(Specific Amplified Polymorphism, 特异性扩增长度多态性)。
5. 微卫星DNA (Microsatellite Repeats) 也称为简单串联重复序列(Simple Sequence Repeat简称SSR)。
6.小卫星DNA(MinisaTel-lte DNA)也称为数目可变串联重复序列(Variable Numbe of Tandem Repeat简称VNYR)。RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)是1990年由美国科学家J.G.K.Williams和加利福尼亚生物研究所J.Welsh领导的两个小组几乎同时发展起来的一种DNA指纹技术，它是以DNA为模板，以一个随机的寡聚核苷酸序列(10个碱基)为引物，通过PCR扩增，产生分子量大小不连续的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA多态性。
DNA多态性是指DNA碱基顺序的差异性。这种差异性不仅存在于不同的植物之间，也存在于同一种植物的不同个体之间。由于碱基顺序的差异，在不同的种或同一个种的不同个体之间，它们的基因组DNA限制性内切酶位点的种类和数目不同，用各自DNA为模板，以一个随机的寡聚核苷酸序列(10个碱基)为引物，通过PCR扩增，产生分子量大小不连续的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色，在紫外检测仪下观察，即可直接看到这种差异，这就是RAPD用用于杂交水稻种子纯度鉴定的工作原理。
PCR(聚合酶链式反应)，即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向DNA合成。PCR循环过程有三种不同的事件发生：1. 模板变性（92-96℃）；2. 引物退火（37-65℃）；3. 热稳定DNA聚合酶进行DNA合成---延伸（72℃）。

变性、退火、延伸的循环过程---PCR扩增。在第二个循环中，新链作为模板参与反应，每完成一个循环将使目的DNA扩增一倍，25-35个循环后，目的DNA将达到106倍。琼脂糖电泳、EB染色即可得到DNA指纹图谱。
PCR反应体系(25%26#61549;l)：
10%26#61620;PCR buffer 2.5%26#61549;l
dNTP (10mmol/L) 0.5%26#61549;l
引物(15ng) 1.0%26#61549;l
Taq 酶 0.5%26#61549;l
模板DNA(纯DNA15ng，提取DNA100ng) 100ng
ddH2O X%26#61549;l

相关知识

一、核酸定量
在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug /ml；单链DNA或RNA为40%26#61549;g/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。
二、分子标记种类
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism 即限制性片断长度多态性)。它是由于核酸序列不同而造成的DNA限制性片断之间产生等位基因差异的结果。要检测到RFLP，在提取核DNA后用限制性内切酶酶解，酶解后的片断通过电泳依大小而分开，将这些片断在变性后转移到固体支持物如尼龙膜上，然后再用具有放射性标记的DNA探针进行杂交，放射性自显影后得到RFLP条带。在观察到一个RFLP时，可用检测出该RFLP的
探针%26#61630;酶的组合追踪该RFLP位点在作图群体中的遗传情况。RFLP标记的优点在于它的标记数量较大,理论上可以布满整个基因组；
其次，它的标记呈共显性，可以区别纯合基因型和杂合基因型，并且标记遵循孟德尔遗传规律；另外，RFLP标记可靠性强，不受显隐性关系、基因互作、下位效应、发育阶段、环境条件以及基因是否表达的影响。但由于ＲＦＬＰ标记技术复杂、操作繁琐、工作量大、具有放射性的危害，DNA用量较大(5～10μｇ)、纯度要求较高,因此限制了它在实际中的广泛使用。利用ＲＦＬＰ标记,可以构建连锁图谱,从而可以进行ＱＴＬ区间定位,可以进行标记辅助筛选，可以对主效基因进行定位和克隆。
2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, 随机扩增多态性DNA)。它是1990年由美国科学家J.G.K.Williams和加利福尼亚生物研究所J.Welsh领导的两个小组几乎同时发展起来的一种DNA指纹技术，它是以DNA为模板，以一个随机的寡聚核苷酸序列(10个碱基)为引物，通过PCR扩增，产生分子量大小不连续的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA多态性。一般讲,通过PCR扩增产生的不连续的几个DNA产物,往往是由于不同的遗传位点而产生,多态性的产生是由于突变或重排而造成的,这些变化可以发生在引物结合位点上,也可以位于引物结合序列之间。RAPD是一种显性的遗传标记，与RFLP标记相比，
其标记数量多,标记的分辨率高，特异性强，DNA用量较少(%26lt;50ｎｇ),对DNA的质量要求也不及RFLP标记技术，同时,RFLP技术依赖于PCR技术,因而它具有快速、方便、高效的特点,因此常常被广泛用于基因的快速定位和遗传作图。但由于RAPD受反应条件影响大,因而检测的重复性较差，会产生一些假象的多态性。其次，RAPD标记为显性标记，不能用来区别杂合和纯合基因型。
3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段的长度多态性)。广义的AFLP是指所有的经PCR反应产生的片段长度的多态性的总
称，而狭义的AFLP专指一种基于PCR反应的AFLP，这是一种选择性地扩增限制性片段的方法。在操作过程中，往往先提取核DNA，并用内切酶降解，之后再连接一个接头,依据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物,即引物=接头+酶切位点+2～3个随机的核苷酸，之后再进行特异性PCR扩增，这种技术将RFLP的随机性与专一性扩增进行巧妙地结合，又通过不同的内切酶以达到选择的目的，故又称为选择性限制片段扩增标记(Selectine Restriction Fragment Amplification 简称SRFA)。AFLP标记所检测的多态性是酶切位点的变化或酶切片段间DNA序列的插入与缺失，本质上与RFLP一致。与上面两种标记技术相比，由于它结合RAPD与RFLP的特长,因而它所提供的基因组多态性信息比RFLP、RAPD多。此外，AFLP标记稳定性强，重复性好，自动化程度高，标记呈显性或共显性，对DNA的数量及质量要求低，并且可以通过控制引物的数目和种类来选择不同的DNA片段以及扩增的DNA片段的数目,因而在实际应用中有着非常好的前景。
4　SAP(Specific Amplified Polymorphism, 特异性扩增长度多态性)。扩增长度多态性)。它是在RAPD和RFLP分析中找到多态性DNA片段后，将该片段两端测序,依据所测DNA序列,重新设计双引物进行特异性ＰＣＲ扩增,这种标记方法又称为序列特异性扩增区(Sequence Characterizal Amplified Region 简称SCAR)。SCAR在不同个体间可能表现为存在/缺失,为显性标记,也可能表现为扩增片段长度的差异,为共显性标记。利用SAP标记可以解决RFLP标记中PCR扩增片段多,不易分析结果及重复的缺点。
5. 微卫星DNA (Microsatellite Repeats)也称为简单串联重复序列(Simple Sequence Repeat简称SSR)。它是基因组中二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸的简单串联重复,由于等位基因间重复次数不同而产生多态性,其检测也采用PCR扩增。与RFLP标记相比,微卫星DNA多态性较高，但构建一张完整的微卫星图谱,工作量大，费用也高，因而在实际中用的较少。
6. 小卫星DNA (Minisatellte DNA)也称为数目可变串联重复序列(Variable Numbe of Tandem Repeat简称VNYR)。小卫星DNA是一种重复的DNA小序列,为十到几百个核苷酸,在基因组中拷贝数从10～10000不等,分散或成簇分布,多态性的产生是由于重复单位间的不平衡交换,从而产生不同的等位基因的结果。小卫星DNA多态性很高,但是由于缺乏探针因而操作起来比较繁琐,同时小卫星DNA分布较集中,因此使它们的应用受到了限制。