简介
对胰岛功能不仅可以体内评估，也可以将胰岛分离出来在培养条件下检测其胰岛素分泌功能，以排除其他组织对整体分析结果的影响，因此分离胰岛作为对胰岛功能独立检测及提取蛋白质或 RNA 用于分子研究都是极为有用的基本操作。
原理
小鼠胰岛的分离纯化实验的基本过程可分为如下几步：
A. 将小鼠用引颈法处死，快速打开腹腔，在体式显微镜下找到胆总管，在靠近十二指肠的部分用手术线将胆总管结扎。
B. 将肝脏上翻，分离胆总管，将其上附着的脂肪轻轻剥离。用显微镊夹住胆总管的上端（靠近肝脏），然后用 4 号半的医用头皮针插入胆总管，用 5 ml 注射器连接头皮针通过胆总管往胰腺灌注预冷的 collagenase 溶液（1 mg/ml collagenase in HBSS，ice-cold）。一般推注 2～3 ml collagenase 溶液可以使小鼠的胰 腺充分膨胀。
C. 将充分膨胀的胰腺分离出来，放入 50 ml 离心管中，再加入 collagenase 溶液 2 ml，置于 37 ℃ 水浴消化 28 分钟。消化期间轻轻摇动离心管，使消化充分。注意：消化的时间和水浴温度都很重要，要尽可能准确。
D. 消化结束后，把离心管置于漩涡振荡器上振摇 10 秒，此时胰腺已经被分解成糜状组织，加入 15 ml 预冷的 HBSS，摇匀以终止消化。
E. 4 ℃，1000 r/min 离心 30 秒，倒掉上清液。
F. 将沉淀用 10 ml 预冷的 HBSS 重悬洗涤，不要用漩涡振荡器，用 1 ml 移液器轻轻将沉淀重悬。将重悬后的悬浊液移入 10 ml 离心管中。在 4 ℃，1000 r/min 离心 30 秒，倒掉上清液。
G. 将上一步所得的沉淀用 5 ml Histopaque 1077 重悬，不要用漩涡振荡器，用 1 ml 移液器轻轻将沉淀重悬。然后用 10 ml 注射器轻轻加入 5 ml 预冷的 HBSS，轻柔加入，使 HBSS 沿着管壁轻轻滑下。加完后，下面 5 ml 为 Histopaque，上面 5 ml 为 HBSS，因为两种液体密度的差异，中间能形成清晰界面。
H. 在 4 ℃，2200 r/min 离心 30 分钟。注意：在此步骤的离心中，需要将离心机的加速和减速都调整到最慢速度，且用水平转子而不能用角转子。
I. 离心结束后取出离心管，可以看见在管中央，不同密度液体的界面处分布着一层沙状的白色小颗粒，即为初步分离纯化的胰岛。用巴氏吸管小心吸出中间层的胰岛，用预冷的 HBSS 洗涤：将吸出的胰岛置于 5 ml 预冷的 HBSS 中，用手轻轻敲打管子，使胰岛分散均匀。然后在 4 ℃，以 1000 r/min 离心 30 秒，将上清弃掉。用预冷的 HBSS 按上述步骤重复洗涤一遍。
J. 将洗涤后的胰岛用含有 10％ 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基重悬，然后放置于 6 cm 培养皿中。在体视显微镜下，用 20 μl 移液器挑取胰岛，对胰岛进行进一步分选。注意：之所以要进行此步骤，是因为初步分离的胰岛中含有少量消化下来的胰腺外分泌细胞。
K. 将挑取出来的胰岛放入含有 10％ 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中，用 6 cm 培养皿在 5％ CO2 的环境下 37 ℃ 于培养箱中培养，以进行下一步的实验。结果示例见图8-9-7。
材料与仪器
器材：体视变焦显微镜（SMZ 800，Nikon）、冷冻离心机（5810 R，Eppendorf）等
试剂：
① Collagenase Type V（Sigma-Aldrich）
② Histopaque 1077（Sigma-Aldrich）
③ RPMI 1640 medium（含 11 mmol/L D-glucose,Invitrogen Gibeo)
④ HBSS(NaCl 114 mmol/L, KCI 4.7 mmol/L, KH2PO,1.2 mmol/L, MgSO 1.16 mmol/L, HEPES 20 mmol/L, CaCl2 2.5 mmol/L, NaHCO3 25.5 mmol/L，用 NaOH 调整 pH 至 7.2～7.4）
步骤
小鼠胰岛的分离纯化实验的基本过程可分为如下几步：
A. 将小鼠用引颈法处死，快速打开腹腔，在体式显微镜下找到胆总管，在靠近十二指肠的部分用手术线将胆总管结扎。
B. 将肝脏上翻，分离胆总管，将其上附着的脂肪轻轻剥离。用显微镊夹住胆总管的上端（靠近肝脏），然后用 4 号半的医用头皮针插入胆总管，用 5 ml 注射器连接头皮针通过胆总管往胰腺灌注预冷的 collagenase 溶液（1 mg/ml collagenase in HBSS，ice-cold）。一般推注 2～3 ml collagenase 溶液可以使小鼠的胰 腺充分膨胀。
C. 将充分膨胀的胰腺分离出来，放入 50 ml 离心管中，再加入 collagenase 溶液 2 ml，置于 37 ℃ 水浴消化 28 分钟。消化期间轻轻摇动离心管，使消化充分。注意：消化的时间和水浴温度都很重要，要尽可能准确。
D. 消化结束后，把离心管置于漩涡振荡器上振摇 10 秒，此时胰腺已经被分解成糜状组织，加入 15 ml 预冷的 HBSS，摇匀以终止消化。
E. 4 ℃，1000 r/min 离心 30 秒，倒掉上清液。
F. 将沉淀用 10 ml 预冷的 HBSS 重悬洗涤，不要用漩涡振荡器，用 1 ml 移液器轻轻将沉淀重悬。将重悬后的悬浊液移入 10 ml 离心管中。在 4 ℃，1000 r/min 离心 30 秒，倒掉上清液。
G. 将上一步所得的沉淀用 5 ml Histopaque 1077 重悬，不要用漩涡振荡器，用 1 ml 移液器轻轻将沉淀重悬。然后用 10 ml 注射器轻轻加入 5 ml 预冷的 HBSS，轻柔加入，使 HBSS 沿着管壁轻轻滑下。加完后，下面 5 ml 为 Histopaque，上面 5 ml 为 HBSS，因为两种液体密度的差异，中间能形成清晰界面。
H. 在 4 ℃，2200 r/min 离心 30 分钟。注意：在此步骤的离心中，需要将离心机的加速和减速都调整到最慢速度，且用水平转子而不能用角转子。
I. 离心结束后取出离心管，可以看见在管中央，不同密度液体的界面处分布着一层沙状的白色小颗粒，即为初步分离纯化的胰岛。用巴氏吸管小心吸出中间层的胰岛，用预冷的 HBSS 洗涤：将吸出的胰岛置于 5 ml 预冷的 HBSS 中，用手轻轻敲打管子，使胰岛分散均匀。然后在 4 ℃，以 1000 r/min 离心 30 秒，将上清弃掉。用预冷的 HBSS 按上述步骤重复洗涤一遍。
J. 将洗涤后的胰岛用含有 10％ 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基重悬，然后放置于 6 cm 培养皿中。在体视显微镜下，用 20 μl 移液器挑取胰岛，对胰岛进行进一步分选。注意：之所以要进行此步骤，是因为初步分离的胰岛中含有少量消化下来的胰腺外分泌细胞。
K. 将挑取出来的胰岛放入含有 10％ 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中，用 6 cm 培养皿在 5％ CO2 的环境下 37 ℃ 于培养箱中培养，以进行下一步的实验。结果示例见图8-9-7。
注意事项
1. 在分离胰腺时，通过胆总管的灌注部分很重要，一定要使胰腺尤其是胰尾部分膨胀充分。
2. 在操作中要注意除了 RPMI 1640，所有的溶液在使用前都要提前预冷。
3. 在最后用 20 μl 移液器挑取胰岛时，在室温进行即可，但速度要尽可能快。
4. 正常情况下，每只小鼠能够抽提出 60～80 个中等大小的胰岛，根据不同的实验需要安排所需要抽提的小鼠数目。
来源：丁香实验
