分离胰岛的糖刺激下胰岛素分泌检测

别名：GSIS

最新修订时间：2022-02-10

材料与仪器

器材：12 孔板、体视显微镜、CO2 培养箱、移液器、EP 管、离心机等

试剂：

① Krebs-Ringer buffer(NaCl 115 mmol/L,KCI 5.4 mmol/L,CaCl2 2.38 mmol/L,MgSO,0.8 mmol/L,Na2HPO4 1 mmol/L,HEPES 10 mmol/L)

② BSA,fatty acid free(Sigma-Aldrich)

③ Rat/Mouse Insulin ELISA kit(LINCO Research）

④ 葡萄糖（glucose）贮液（1 mol/L）

⑤ 精氨酸（arginine）贮液（0.5mol/L）

⑥ KRB buffer（Krebs-Ringer buffer + 0.2% fatty acid free BSA)。

步骤

分离胰岛的糖刺激下胰岛素分泌检测的基本过程可分为如下几步：

A. 准备 12 孔板，每个孔加入 750 μl 的 KRB buffer。

B. 在体视显微镜下，将 CO₂ 培养箱中培养的胰岛用 20 μl 移液器挑选出来，放入 12 孔板中，每个孔放入 15～20 个胰岛，尽量保证各个孔的胰岛大小和数目一致。

C. 将 12 孔板于 37 ℃ CO₂ 培养箱中放置 1 小时，使胰岛适应培养液的转换（从 RPMI 1640 到 KRBbuffer)。

D. 将 12 孔板从培养箱中取出，放置桌上轻轻旋转摇动，胰岛会慢慢聚集到每个孔的中央。用 20 μl 移液器将胰岛移入到加有 KRB buffer（含有 2.8 mmol/L glucose）的新的 12 孔板中，每个孔 750 μl。然后将其置于 37 ℃ CO₂ 培养箱放置 1 小时，以得到胰岛的基础胰岛素分泌（basal secretion）水平。

E. 将 12 孔板从培养箱中取出，放置桌上轻轻旋转摇动，胰岛会慢慢聚集到每个孔的中央。移取 100 μl 培养液于 EP 管中，放置于冰上保存，用于随后的基础胰岛素分泌水平的检测。

（1）葡萄糖刺激下的胰岛素分泌：用 20 μl 移液器将胰岛移入加有 KRB buffer（含有 16.7 mmol/L glucose）的新的 12 孔板中，每个孔 750 μl。然后将其置于 37 ℃ CO₂培养箱 1 小时，以得到胰岛在糖刺激下的胰岛素的分泌（glucose-stimulated secretion）水平。

（2）精氨酸刺激下的胰岛素分泌：用 20 μl 移液器将胰岛移入到加有 KRB buffer（含有 10 mmol/L arginine）的新的 12 孔板中，每个孔 750 μl。然后将其置于 37 ℃ CO₂培养箱 1 小时，以得到胰岛在精氨酸刺激下的胰岛素的分泌（arginine-stimulated secretion）水平。

F. 将 12 孔板从培养箱中取出，放置桌上轻轻旋转摇动，胰岛会慢慢聚集到每个孔的中央。移取 100 μl 培养液于 EP 管中，放置于冰上保存，用于随后的葡萄糖或精氨酸刺激下胰岛素分泌水平的检测。

G. 用 20 μl 移液器将胰岛移入到 EP 管中，加入 1 ml HBSS 或 KRB buffer，然后以 1000 r/min 在室温离心 2 分钟。沉淀下来的胰岛可以保存于 -80 ℃ 冰箱，以备用于提取蛋白或 RNA 之类的实验。

H. 将步骤 5 和步骤 6 得到的培养液于 4 ℃，5000 r/min 离心 5 分钟，以去掉某些脱离的细胞碎片或杂质。上清液移入到新的 EP 管，用于胰岛素的 ELISA 检测。也可以将上清分装保存于 -80 ℃ 备用，但避免反复冻融。结果示例如图 8-9-8 所示。

注意事项

1. 胰岛纯化出来后，应该在 RPMI 1640 中培养过夜，这样可以恢复胰岛的功能。因为分离纯化不可避免地会对胰岛造成一定的损伤，原代培养过夜后，胰岛外层受损的细胞会脱落，胰岛表面会重新形成包膜，轮廓变得圆润清晰。在实验开始前，要注意观察所培养的胰岛状态，如果胰岛的轮廓毛糙，证明胰岛抽提中损伤过大，不宜用于进行分泌实验。

2. 所有溶液都要通过高压或过滤灭菌达到无菌的细胞培养要求。

3. 每组胰岛至少应该安排 4 个孔，即 60 个大小均一的胰岛以上。

4. 葡萄糖或精氨酸刺激后的培养液用于胰岛素的 ELISA 检测时，应用 KRB buffer 稀释 5～10 倍。

来源：丁香实验