分离纯化总RNA

1） 用酸性酚 - 硫氰酸胍 - 氯仿提取纯化组织和细胞中的 RNA

1. 选取从组织细胞或细胞中提取 RNA 的适宜方法

组织

a. 分离组织并立即置于液氮中。

b. 将约 100 mg 冰冻组织含液氮的研钵中，用研棒研磨。研磨过程中可加入液氮使组织保持冰冻状态。

c. 将组织碎末移入含 3 ml 溶液 D 的管中。

D 溶液（变性液）

4 mol/L 硫氰酸胍

25 mmol/L 柠檬酸钠・ 2H₂ O

0.5% （ m/V ）月桂基磺酸钠

0.1 mol/L β - 巯基乙醇

将 250 g 硫氰酸胍、 0.75 mol/L （ pH 7.0 ）柠檬酸钠 17.6 ml 和 26.4 mol 10% (m/V) 月桂基磺酸钠于 293 ml 水中。加入搅拌子于磁力搅拌器上 65 ℃混匀，直至完全溶解。室温贮存溶液 D ，每次临用前加入 14.4 mol/L 的β - 巯基乙醇，每 50 ml 溶液 D 加 0.36 ml 。溶液 D 可在室温下避光保存数月。注意胍基盐在低温下易沉淀。

d. 用搅拌子室温下搅拌组织 15~30s 。

哺乳动物悬浮细胞

a. 室温下 200~1900 g 离心 5~10 min （ 1000~3000 r/min 用 Sorvall RT600, H1000 转子）收获细胞。

b. 吸出培养基将细胞重悬于 1~2 ml 冰预冷的 PBS 中。

c. 离心收获细胞，彻底吸尽 PBS ，每 10⁶ 细胞加 2 ml 溶液 D 。

d. 用搅拌子室温下搅拌细胞 15~30 s 。

哺乳动物单层培养细胞

a. 吸出培养基用 5~10 ml 冰冷的 PBS 洗细胞一次。

b. 吸出 PBS 加入溶液 D 覆盖细胞， 90 mm 培养皿加 2 ml （ 60 mm 培养皿加 1 ml ）。

c. 将细胞溶解物移至管中。

d. 用搅拌子室温下搅拌溶解细胞 15~30 s 。

2. 将混合物移至一管中，在每毫升溶液 D 中立即加入 0.1 ml 2 mol/L 的醋酸钠（ pH 4.0 ）， 1 ml 酚， 0.2 ml 氯仿 - 异戊醇。加入每组组分后，盖上管盖，倒置混匀。

3. 将匀浆剧烈振荡 10 s 。冰浴 15 min 使核蛋白质复合体彻底裂解。

4. 10 000 g （ 9000 r/min 用 Sorvall SS-34 转子） 4 ℃离心 20 min ，将上层含 RNA 的水相移入一新管中。

5. 加入于提取的 RNA 等量的异丙醇。充分混合液体，并在 -20 ℃沉淀 RNA 1h 或更长时间。

6. 10 000g (9000 r/min 用 Sorvall SS-34 转子 )4 ℃离心 30 min ，收集沉淀的 RNA 。

7. 轻轻倒出异丙醇加入溶液 D 溶解 RNA 颗粒，每 1 ml 第一步所使用的溶液加 0.3 ml 溶液 D 。

8. 将溶液移至一微量离心管，涡旋混匀，并在 -20 ℃用等量异丙醇沉淀 RNA 1h 或更长时间。

9. 在微量离心机上，于 4 ℃最大速离心 10 min 收集 RNA 沉淀。用 75% 的乙醇洗涤沉淀 2 次，重复离心。用一次性使用的吸头吸出残存的乙醇。将打开盖的离心管在实验台放置几分钟，以便乙醇蒸发。 RNA 不可完全干燥。

10. 加 50 ～ 100 μ l DEPC 处理过的水。将 RNA 溶液贮存于 -70 ℃。

11. 估计 RNA 的浓度。

2） 根据大小分离 RNA ：乙二醛化 RNA 的琼脂凝胶电泳

1. 配制乙二醛变性反应液。在无菌离心管中混合：

RNA （总共 10 μ g ） 1 ～ 2 μ l

乙二醛反应混合液 10 μ l

2. 盖上离心管的盖子，将 RNA 溶液在 55 ℃放置 60 min ，在冰水中冰浴 10 min ，然后离心 5 s ，使所有液体沉到离心管底部。

3. 在样品加热过程中，将琼脂凝胶装到水平电泳仪的盒子中。加入足够的 1 × BPTE 电泳缓冲液，使其没过凝胶约 1 mmol/L 。

4. 将 1 ～ 2 μ l RNA 上样缓冲液加到乙二醛化的 RNA 样品中，然后马上把 RNA 样品加到凝胶加样孔中，留着两边最外面的两个孔不要加样。将 RNA 相对分子质量标准参照物加到最外面的孔中。

5. 以 5 V/cm 的电压进行电泳，直到溴酚蓝迁移大约 8cm 。

6. 将凝胶放在保鲜膜上，在紫外灯下观察 RNA 。把透明尺和凝胶对齐，在紫外灯下拍照。

7. 在照片上量出从加样孔到各 RNA 条带的距离。 以 RNA 片段大小的对数（ log₁₀ ）值对迁移的距离作图。用得到的曲线计算点杂交检测到的 RNA 的大小。

8 ．用上行或下行毛细管转移法把 RNA 固定在固体支持物上。