蛋白质分离纯化的基本原则？

蛋白质分离纯化的基本原则主要包括:

1. 保持蛋白的生物活性:选择温和的缓冲系统,控制温度,加入稳定剂等,以保持蛋白的天然结构和活性。

2. 渐进法纯化:通常需要多步骤分离,每一步移除一部分杂质,逐步提高目标蛋白纯度。

3. 充分利用蛋白质的化学与物理性质差异进行分离:如大小、电荷、亲和特性等。

4. 保持蛋白质溶解状态:控制pH、离子强度、去离子水溶液成分等关键因素。

5. 避免蛋白质降解:加入抑制蛋白酶和其他降解因子的物质,控制温度。

6. 提高产率:采用最优化方案,尽量减少非特异性损失。

7. 样本准备充分:细胞裂解和释放蛋白质,去除细胞碎片和不溶性沉淀。

8. 过程监控:利用裂解液上清的吸光度、电泳检测等判断各步骤效果。

9. 质量控制:进行酶活性测定、电泳纯度检测等评估纯化蛋白的效果。

10. 记录详细过程:方便重复实验和优化方案。

基本原则：

根据蛋白质的溶解性、分子大小、电荷、特殊的亲和力的差异 进行分离纯化。

蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。

蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。一般蛋白纯化采用的方法为树脂法。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，必要时可加入相应的保护剂（例如蛋白酶抑制剂），防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。

根据蛋白质的溶解性、分子大小、电荷、特殊的亲和力的差异 进行分离纯化。