混合液浸提法

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的光密度D与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：

D=kCL

式中：k为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，k为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的光密度而求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总光密度等于各组分在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的光密度D，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素a、b的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：

D663 = 82.04Ca+9.27Cb                                             （1）

D645 = 16.75Ca+45.60Cb                                            （2）

式（1）、（2）中的D663和D645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的光密度，Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度，以mg/L为单位。解方程组（1）、（2），得：

Ca = 12.72D663 – 2.59D645                                          （3）

Cb = 22.88D645 – 4.67D663                                          （4）

将Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）：

CT = Ca + Cb =20.29D645 + 8.05D663                                  （5）

另外，由于叶绿素a、b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次光密度（D652）而求出叶绿素a、b总量：

CT =（D652 × 1000）/ 34.5                                          （6）

在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。

Lichtenthaler等对Arnon法进行了修正，提出了80%丙酮提取液中三种色素含量的计算公式：

Ca = 12.21D663 – 2.81D646                                           （7）

Cb = 20.13D646 – 5.03D663                                          （8）

Cx·c=（1000D470 – 3.27Ca – 104Cb）/ 229                             （9）

式中：Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度；Cx·c为类胡萝卜素的总浓度；D663、D646和D470分别为叶绿体色素提取液在波长663nm、646nm和470nm下的光密度。由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素a、b在96%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，类胡萝卜素为470nm，可据此列出以下关系式：

Ca = 13.95D665 – 6.88D649                                         （10）

Cb = 24.96D649 – 7.32D665                                         （11）

Cx·c=（1000D470 – 2.05Ca – 114.8Cb）/ 245                           （12）

1. 取新鲜植物叶片（或其他绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2——3ml 96%乙醇（或80%丙酮）研成匀浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白，静置3——5min。

3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。

5. 把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以96%乙醇为空白，在波长665nm、649nm和470nm下测定光密度。

6. 按公式（10）、（11）、（12）（如用80%丙酮，则按公式7、8、9）分别计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度（mg/L），（10）、（11）式相加即得叶绿素总浓度。

7. 求得色素的浓度后计算组织中各色素的含量。

1. 为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。

2. 叶绿体色素提取液不能浑浊。可在710nm或750nm波长下测量光密度，其值应小于当波长为叶绿素a吸收峰时光密度值的5%，否则应重新过滤。

3. 用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差1nm，则叶绿素a的测定误差为2%，叶绿素b为19%，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素a和b来校正。

4. 在使用低档型号分光光度计（如：72型、125型、721型等）测定叶绿素a、b含量时，因仪器的狭缝较宽，分光性能差，单色光的纯度低（±5——7nm），与高中档仪器如岛津UV-120、UV-240等测定结果相比，叶绿素a的测定值偏低，叶绿素b值偏高，a/b比值严重偏小。因此，使用时必须用高档分光光度计对低档的分光光度计进行校正。