叶绿体色素的定量测定

叶绿体色素的定量测定的基本原理是根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度c和液层厚度L成正比，即：

A = kcL    （14-1）

式中：A一消光度；

c一溶质浓度；

L—液层厚度；

k一比例常数。

当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 1 cm 时，为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数，可测定已知浓度的纯物质在不同波长下的消光度而 求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总消光度等于各组分在相应波长下消光度的总和，这就是消光度的加和性。测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a、叶绿素 b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在 3 个特定波长下的吸光度 A ，并根据叶绿素 a、叶绿素 b 及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素 a、叶绿素 b 时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素 a、叶绿素 b 的 80% 丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为 663 nm 和 645 nm，又知在波长 663 nm 下，叶绿素 a、叶绿素 b 在该溶液中的比吸收系数分别为 82.04 和 9.27，在波长 645 nm 下分别为 16.75 和 45.60，可根据加和性原则列岀以下关系式：

A₆₆₃ = 82.04 c_a + 9.27 c_b    （14-2）

A₆₄₅ = 16.75 c_a + 45.60 c_b    （14-3）

式中：A₆₆₃、A₆₄₅—叶绿素溶液在波长 663 nm 和 645 nm 时的消光度；

c_a、c_b一叶绿素 a 和叶绿素 b 的浓度，mg・L^-1_。

解方程组（14-2）、（14-3）得：

c_a = 12.72 A₆₆₃ - 2.59 A₆₄₅    （14-4）

c_b = 22.88 A₆₄₅ - 4.67 A₆₆₃    （14-5）

将c_a 与 c_b 相加即得叶绿素总量c_T

c_T = c_a + c_b = 20.29 A₆₄₅ + 8.05 A₆₆₃    （14-6）

另外，由于叶绿素 a、叶绿素 b 在 652 nm 的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为 34.5），也可以在此波长下测定一次消光度（A₆₅₂）而求出叶绿素 a、叶绿素 b 总量：

c_T =（A₆₅₂ × 1 000）/34.5    （14-7）

在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。Li-chten-thaler 等对 Arnon 法进行了修正，提出了 80% 丙酮提取液中 3 种色素含量的计算公式：

c_a = 12.21 A₆₆₃ - 2.81 A₆₄₆    （14-8）

c_b = 20.13 A₆₄₆ - 5.03 A₆₆₃    （14-9）

c_x._c =（1 000 A₄₇₀ - 3.27 c_a - 104 c_b）/229    （14-10）

式中：c_a、c_b—叶绿素 a、b 的浓度；

c_x._c一类胡萝卜素的总浓度；

A₆₆₃、A₆₄₅ 和 A₄₇₀—叶绿体色素提取液在波长 663 nm、646 nm 和 470 nm 下的消光度。由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时计算公式也有所不同。叶绿素 a、叶绿素 b 在 95% 乙醇中最大吸收峰的波长分别为 665 nm 和 649 nm，类胡萝卜素为 470 nm，可据此列出以下关系式：

c_a = 13.95 A₆₆₅ - 6.88 A₆₄₉    （14-11）

c_b = 24.96 A₆₄₉ - 7.32 A₆₆₅    （14-12）

c_x._c =（1 000 A₄₇₀ - 2.05 c_a - 114.8 c_b）/245    （14-13）