叶绿体色素的分离

绿色植物的光合作用是在叶绿体中进行的，了解叶绿体色素的组成和性质对于理解光合作用的本质很有帮助。叶片中叶绿素含量与光合强度以及氮素营养又有密切关系。因此，测定叶绿素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在作物育种、科学施肥、看叶诊断中有着广泛的应用。

原理

当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。下面介绍纸层析和硅胶薄板层析分离叶绿体色素的方法。

一、纸层析法分离叶绿体色素

器材与试剂

方法一需要：大试管、软木塞、大头针、回形针、滤纸、毛细管、电吹风、剪刀、四氯化碳、无水硫酸钠。

方法二需要：培养皿一套(底和盖口径相同)、滤纸、剪刀、小烧杯(5ml)、汽油、苯。

方法与步骤

方法一：将2×22cm的滤纸的一端剪去二侧，中间留一长约1.5cm、宽约0.5cm窄条。用毛细管取叶绿体色素浓溶液点于窄条上端，用电吹风吹干，如一次点样量不足可反复在色点处点样数次，使色点上有较多的叶绿体色素。在大试管中加入四氯化碳3-5ml及少许无水硫酸钠。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中，而色点略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁，软木塞盖紧，直立于阴暗处层析。

0.5-1小时后，观察色素带分布：最上端橙黄色(胡萝卜素)，其次黄色(叶黄素)，再崐次蓝绿素(叶绿素a)，最后是黄绿色(叶绿素b)。

方法二：取一张色层分析滤纸，剪成直径稍比培养皿直径大一点的圆形(正方形也可)，在滤纸的中心戳一小孔。另取一长5cm、宽1.5cm的滤纸条，用滴管吸取叶绿体色素提取液滴在纸条一边，使色素扩展的宽度限制在0.5cm以内，电吹风吹干后，再重复数次，(也可把浓叶绿体色素溶液放在平底培养皿中，用滤纸一侧蘸叶绿体色素)，然后将纸沿着长轴方向卷成纸捻，使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰好在纸捻的一端。

将纸捻带有色素的一端插入图形滤纸的中心处的小孔中，使与滤纸刚刚平齐。

在培养皿内放一小烧杯(5ml)，杯内加入适量汽油和1～2滴苯，把插有纸捻的滤纸平放在培养皿上，使纸捻的下端浸在汽油中，盖好培养皿，此时汽油借毛细管引力顺捻扩散到圆形滤纸上，并把叶绿体色素沿着滤纸的四周推进，不久即可看到被分离的各种色素的同心环，待汽油将要达到培养皿边缘时，取出滤纸，用笔标出各色素位置与名称、叶绿素a呈蓝绿色，叶绿素b呈黄绿色，叶黄素呈鲜黄色胡萝卜素为橙黄色。

二、硅胶薄板层析分离叶绿体色素

器材与试剂

器材：FS玻璃板(5×20cm2)、烘箱、干燥器、层析缸、毛细管、电吹风、分光光度计、

解剖针、刀片、试管、试管架等。

试剂：硅胶G、苯、冰醋酸。

方法与步骤

1. 层析板制作。将硅胶G与蒸馏水以1：2比例混合，加几滴酒精搅匀后，均匀涂布在干净的玻璃板上，成一薄层，并平放在水平桌面上凉干，然后放在105-110℃烘箱中烘半小时，置干燥器中备用。

2. 点样。用毛细管或微量注射器吸取浓缩的叶绿体色素点样于薄板上，并成一直线(离一端1.5-2cm处)，也可反复点样数次，以增加薄层对样品的载量，点样线不可太粗，应控制在2mm左右。

3. 展层：将点过样的薄板置于已预先用苯：冰醋酸为9：1的展层溶剂(也可用石油醚:丙酮:正丁醇=90:10:4.5的混合液)饱和的层析液中，点样线高于展层溶剂，采用上行垂直展层，待展层溶剂前沿走至离玻璃板另一端还有1-2cm时取出，可观察到色素已分离为若干条色带，加以记录和辨认。

4. 计算分配系数(Rf)值：

原点到层析点中心的距离(r)/原点到溶剂前沿的距离

5. 色素吸收光谱的测定：

① 将薄层层析分离出的各色素用刀片或解剖针刮入具塞试管中。

② 各加入5ml的丙酮，溶解后，倾出各管上清液备用。

③ 将各管上清液分别倒入比色杯，以丙酮为空白，在分光光度计上测定各种色素的吸收光谱(自400nm开始，直读到750nm为止，每隔10nm记录一次透光率)，并在坐标纸上，以波长为横坐标，透光率为纵坐标，画出各色素的吸收光谱曲线。