实验30 叶绿体色素的分离（柱层析法）

叶绿体色素的分离（柱层析法）

原理

　　吸附剂如蔗糖、Al2 O3 、MgO、CaCO3 等对各种物质有不同的吸附力，吸附力的大小随吸附剂的种类而异；同一吸附剂在不同的溶剂中吸附力的大小也不同。被吸附的物质由于其结构中极性基团的种类和数量不同，吸附力也不相同。

各种官能团的极性大小次序为；－CH2 －CH2 －＜－CH=CH＜－CH=CH－CH=CH－＜－OCH3 ＜－COOR－＜－C=O＜－CHO＜－SH＜－NH2 ＜－OH＜－COOH。

　　本实验是把蔗糖粉末填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。

由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。

仪器药品

　　铜筛 　　　　　真空泵

　　过滤瓶 　　　　分液漏斗

　　研钵 　　　　　量筒

　　具塞三角烧瓶 　小漏斗

　　螺旋夹 　　　　乳胶管

　　层析柱（直径1梍1.5cm，长约15梍20cm）_

　　石油醚　　　　 丙酮

　　无色汽油 　　　苯

　　乙醚 　　　　　碳酸钙

　　氯化钠

　　蔗糖：将蔗糖磨细，过筛（筛孔0.10mm），为增强吸附力，使用前需在70─75℃下烘2小时。

操作步骤

　　1．色素的提取

　　称取绿色组织2g，弃去粗大叶脉后剪成碎块，放在干净的研钵内，加入少量碳酸钙和石英砂，以及少量丙酮（干材料用85%丙酮，新鲜材料用无水丙酮），研磨成匀浆。减压过滤，滤液收集于量筒中，残渣再用丙酮洗涤数次，直至无色，定容20ml。提取液经反射光照射应观察到血红色荧光。

　　丙酮提取液中不仅有叶绿体的色素，而且也有能溶于丙酮中的化合物，为了更好地分离色素，必须用石油醚纯化色素。

　　纯化色素时将丙酮提取液转入分液漏斗中，加等量石油醚，轻轻摇动，再加等量饱和NaCl溶液振摇，再加等量蒸馏水振摇，放置分层。待明显分为两层，上层为深绿色石油醚层，有显著的荧光性。小心地把下面的丙酮水液层放掉，用洗瓶沿漏斗壁以水洗涤石油醚层6─7次，以彻底洗去丙酮。定容为20ml，所得石油醚色素提取液置于棕色瓶中待用。

　　2．吸附柱的制备

　　(1) 干法装柱

　　把层析柱的玻管部分固定在抽滤瓶上，在玻管的基部用清洁的脱脂棉填上，使松紧合适，于其上放一大小合适的圆形滤纸片，柱的上端放一小漏斗，取烘过的蔗糖粉由小漏斗装入柱中，边装边轻敲柱外壁，随后进行抽气，使蔗糖柱紧实，约为15cm长。

装好吸附剂后于其上轻轻盖上一片大小合适的圆形滤纸，小心地注入石油醚，抽滤，当蔗糖柱全部被石油醚浸湿，且在柱上面留有少量石油醚时，停止抽吸。

　　(2) 湿法装柱

　　层析柱用夹子垂直固定于铁架上，下端套上一段乳胶管，在乳管的另一端套上一玻璃管，在乳胶管上夹一螺旋夹，以控制流速。柱子下端同样填上脱脂棉，放上小滤纸片，柱上放一小漏斗。先关闭螺旋夹，注入一定体积的石油醚于柱中，打开螺旋夹，让石油醚以每秒1滴的流速流下，当注入的石油醚流至柱的3/4处，从小漏斗缓缓装入蔗糖粉，抽吸，并在蔗糖柱上盖一滤纸片，待石油醚快流完时，停止抽吸。

　　3．色素的分离

　　将色素提取液2ml倾入吸附柱上，当色素提取液将要全部进入蔗糖柱中，加入一定体积的石油醚冲洗，抽吸，至柱上的颜色快要扩展到吸附柱的下端时，就在柱上出现不同颜色的色带，上面是黄绿色的叶绿素b，其次是蓝绿色的叶绿素a，再下面是黄色的叶黄素，胡萝卜素没有被蔗糖吸附，出现在柱的最下端或随洗脱剂石油醚进入抽滤瓶中。

　　4．色素的洗脱

　　分布在柱上各色带的位置彼此很接近，为了更好地分离，需将各色带分开有较大的距离。

为此可加入10─15ml汽油—苯的混合液）（10∶1），抽滤，混合液渗入后，胡萝卜素从吸附柱上全部排出，叶黄素与叶绿素a分开，并逐渐被洗脱下来。这时再加入汽油—苯的混合液（1∶2），抽滤，叶绿a和叶绿素b更清楚地分开，叶绿素a被洗脱，叶绿素b可用乙醚（或乙醇）洗脱。

　　注：为了更好地观察叶绿体的4种主要色素，可在柱子的最下端装入中性氧化铝，约占柱长的1/5，上面再装蔗糖，制成吸附剂的混合柱，这样从上到下为叶绿素b，叶绿素a，叶黄素和胡罗卜素，4种色素会很好地分离。