叶绿体色素的提取、分离和理化性质观察

叶绿体色素有吸收、传递和转化光能的作用，提取与分离叶绿体色素是研究光合色素特性的第一步，学习与了解这些光合色素的性质有助于认识和探究其在光合作用中的功能，通过本实验掌握叶绿体色素的提取分离方法及叶绿素的一些理化性质。

叶绿体色素的提取、分离和理化性质观察的基本原理是叶绿体色素主要由叶绿素 a、叶绿素 b、胡萝卜素和叶黄素组成。它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。叶绿素与类胡萝卜素都具有特异的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。

叶绿素荧光现象：当叶绿素分子吸收光量子而转变成激发态时，分子很不稳定，当它变回到基态时发射出红光量子，称为荧光现象。所以，透射光下观察浓叶绿体色素提取液呈绿色，反射光观察浓叶绿体色素提取液呈红色。

叶绿素是一种二梭酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，因而可与碱发生皂化作用，产生的盐可溶于水中，利用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。

叶绿素分子中的镁可被 H⁺ 所取代而形成褐色的去镁叶绿素。后者遇铜形成的绿色的铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作标本；叶绿素分子的化学性质也很不稳定，易受强光破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。

材料：新鲜植物叶片。

试剂：

95% 乙醇（或丙酮）；碳酸钙；石英砂；汽油（纯净无色的）；苯；醋酸铜粉末；50% 醋酸；KOH 甲醇溶液：20 g KOH 用 100 mL 甲醇溶解，盛在具塞的试剂瓶中；醋酸铜-醋酸溶液：量取 50% 醋酸 100 mL 溶入醋酸铜 6 g， 用时加蒸馏水稀释 4 倍。

器材：

① 天平
② 剪刀
③ 研钵
④ 漏斗
⑤ 培养皿 1 套（底和盖直径相同）
⑥ 蒸发皿
⑦ 滤纸条（2 cm × 5 cm 左右）
⑧ 圆形滤纸
⑨ 蒸发皿
⑩ 电热吹风机
⑪ 小烧杯
⑫ 试管
⑬ 酒精灯
⑭ 铁三脚架
⑮ 石棉网
⑯ 移液管
⑰ 滴管
⑱ 玻璃棒

叶绿体色素的提取、分离和理化性质观察的基本过程可分为如下几步：

1. 叶绿体色素的提取和荧光现象的观察：称取菠菜或其他植物新鲜叶片 2~3 g，去掉中脉剪碎，放入研钵中，加入少量石英砂及碳酸钙粉，加 5 mL 95% 乙醇，研磨成匀浆，再加 5 mL 95% 乙醇，提取 3~5 min，过滤于试管中，再用 3 mL 95% 乙醇冲洗残渣。对浓叶绿体色素提取液观察透射光和反射光的颜色，解释其原因。

2. 叶绿体色素的分离：

（1）取一张圆形滤纸（最好用色谱层析滤纸剪成圆形）。在滤纸的圆心戳一圆形小孔，另取一张滤纸条（2 cm × 5 cm 左右，纸条的宽度主要根据培养皿的高度确定）。用滴管吸取浓 叶绿素提取液滴在纸条的一边，使色素扩展的宽度限制在 0.5 cm 以内，用电热吹风机吹干后，再重复操作数次，然后将纸沿着长度的方向卷成纸捻，这样浸过叶绿体色素的一边恰在纸捻的一端。

（2）将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，与滤纸刚刚平齐（勿突出）。

（3）在培养皿中放蒸发皿，蒸发皿内加入适量汽油和 2~3 滴苯，将插有纸捻的圆形滤纸平放在培养皿上，使滤纸的下端（无色素的一端）浸入汽油中，迅速用同一直径的培养皿盖上。此时，叶绿体色素在推动剂的推动下沿着滤纸向四周移动，不久即可看到被分离的各种色素的同心圆环。

（4）待汽油将要到达滤纸边缘时，取出滤纸，待汽油挥发后，用铅笔标出各种色素的位置和名称。

3. 叶绿体色素的其他理化性质：将 1 中提取的叶绿体色素溶液用 95% 乙醇稀释 1 倍，进行以下实验。

（1）皂化作用（叶绿素与类胡萝卜素的分离）：用移液管吸取叶绿体色素提取液 5 mL 于试管中，加入 1.5 mL 20% 氢氧化钾甲醇溶液，充分摇匀。片刻后，加入 5 mL 苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入 1.5 mL 蒸馅水，轻轻混匀（不要剧烈摇荡），静置在试管架上，可看到溶液逐渐分为两层，下层是稀乙醇的溶液，其中溶有皂化叶绿素 a 和叶绿素 b，上层是苯溶液，其中溶有胡萝卜素和叶黄素。

（2）H⁺ 和 Cu²⁺ 对叶绿素分子中 Mg²⁺ 的取代作用：

① 取 2 支试管，第一支试管加叶绿体色素提取液 2 mL，作为对照。第二支试管中加叶绿体色素提取液 5 mL，再加入数滴 50% 醋酸，摇匀，观察溶液的颜色变化。

② 当溶液变褐色后，倒出一半于另一试管中，加入醋酸铜粉末少许，于酒精灯上微微加热，观察溶液的颜色变化，与未加醋酸铜的一半相比较。

③另取醋酸铜溶液 20 mL 左右，加入烧杯中。取新鲜植物叶片 2 片，放入溶液中，用酒精灯缓缓加热，观察并记录叶片的颜色变化，直至颜色不再变化为止。解释原因。

（3）光对叶绿素的破坏作用：

① 取 4 支小试管，其中两支各加入 5 mL 用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入 2.5 mL 叶绿体色素乙醇提取液，并用 95% 乙醇稀释 1 倍。

② 取 1 支装有叶绿体色素乙醇提取液的试管和 1 支装有水研磨叶片匀浆的试管，放在直射光下，另外两支放到暗处，40 min 后对比观察颜色有何变化，解释其原因。

③ 另取本实验中用圆形滤纸层析分离成的色谱一张，通过圆心裁成两半，一半放在直射日光下，另一半放在暗处，半小时后比较两张色谱上的 4 种色素的颜色各有何变化。

1. 在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。可剧烈摇匀，放在 30~40 ℃ 的水浴中加热，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。

2. 分离色素用的圆形滤纸，在中心打的小圆孔，周围必须整齐，否则分离的色素不是一个同心圆。