叶绿体色素的提取与分离

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【原理】
叶绿体 中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为色素蛋白复合体，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色层分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。
【仪器与用具】
研钵2套；漏斗；100ml三角瓶；玻璃棒；剪刀；滴管；培养皿（直径11cm）；康维皿或平底短玻管（也可用塑料药瓶盖代替）；药勺；圆形滤纸（直径11cm）；滤纸条（5cm×1.5cm）。
【试剂】
95%乙醇；石英砂；碳酸钙粉；
推动剂：按石油醚︰丙酮︰苯（10︰2︰1）比例配制（体积比）。
【方法】
1．叶绿体色素的提取
（1）取菠菜或其他植物 新鲜叶片4～5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。
（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2～3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10～15ml 95%乙醇，提取3～5min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。
如无新鲜叶片，也可用事先制好的叶干粉提取。取新鲜叶片（以菠菜叶最好），先用105℃杀青，再在80℃下烘干，研成粉末，密闭贮存。用时称叶粉1g放入小烧杯中，加95%乙醇20～30ml浸提，并随时搅动。待乙醇呈深绿色时，滤出浸提液备用。
（3）另取一研钵，放入剪碎的新鲜叶片，放入少量石英砂（不加碳酸钙粉），用水研磨。先加2ml蒸馏水，研至糊状，再加蒸馏水30ml，搅均，不过滤。
2．叶绿体色素的分离
（1）取圆形定性滤纸一张（直径11cm），在其中心戳一圆形小孔（直径约3mm）。另取一张滤纸条（5cm×1.5cm），用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液沿纸条的长度方向涂在纸条的一边，使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，风干后，再重复操作数次，然后沿长度方向卷成纸捻，使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。
（2）将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿凸出）。
（3）在培养皿内放一康维皿，在康维皿中央小室中加入适量的推动剂，把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿（图16-1）。此时，推动剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，不久即可看到各种色素的同心圆环。
如无康维皿，也可在培养皿中放入一平底短玻管或塑料药瓶盖，以盛装推动剂。但所用培养皿底、盖直径应相同，且略小于滤纸直径，以便将滤纸架在培养皿边缘上。
（4）当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。用铅笔标出各种色素的位置和名称。