叶绿体色素的提取与分离

一、原理

叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜蛋白相结合成为色素蛋白复合体。它们的化学结构不同，所以它们的物化性质（如极性、吸收光谱）和在光合作用中的地位和作用也不一样。这两类色素是酯类化合物，都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙醇等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。

二、材料、仪器设备和试剂

1. 材料：菠菜、小白菜叶片

2. 仪器设备：研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，滴管，培养皿（直径11cm），广口瓶，圆形滤纸（直径11cm）

3. 试剂：95%乙醇，石英砂，碳酸钙粉，推动剂:按石油醚:丙酮:苯=10:2:1比例配制（v/v）

三、试验步骤

1. 叶绿体色素的提取

（1） 取菠菜或其他植物新鲜叶片4-5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。

（2） 研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2-3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10-15ml 95%乙醇，离心35min，提取上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。

（3） 如无新鲜叶片，也可用事先制好的叶干粉提取。取新鲜叶片（以菠菜叶最好），先用105℃杀青，再在80℃下烘干，研成粉末，密闭储存。用时称叶粉2g放入小烧杯中，加95%乙醇20-30ml 浸提，并随时搅动。待乙醇呈深绿色时，滤出浸提液备用。

2. 叶绿体色素的分离

（1） 取圆形定性滤纸一张（直径11cm），将其剪成滤纸条（9cm×3cm），用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液，沿纸条的长度方向涂在纸条的一边（距边约1cm），使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，风干后，再重复操作数次。

（2） 在层析缸中加入适量的推动剂，将滤纸条带有色素的一端插入层析缸中，使滤纸条下端浸入推动剂中。迅速盖好层析缸盖。此时，推动剂借毛细管引力顺滤纸条向上扩散，并把叶绿体色素向上推动，不久即可看到各种色素的条带。

（3） 当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。用铅笔标出各种色素的位置和名称。