蛋白质分离纯化，用什么方法最好？

一、常用的破碎组织细胞的方法有：

　　1.机械破碎法

　　这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

　　2.渗透破碎法

　　这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

　　3.反复冻融法

　　生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

　　4.超声波法

　　使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

　　5.酶法

　　如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

　　二、蛋白质分离纯化抽提

　　通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等)，使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

　　三、蛋白质粗制品的获得

　　选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：

　　1.等电点沉淀法

　　不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。

　　2.盐析法

　　不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。

　　3.有机溶剂沉淀法

　　中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。

电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。

层析：

a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定PH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。

b.分子筛，又称凝胶过滤。小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。

蛋白质的分离纯化是一个用亲和层析法对 蛋白质分离 的过程，分离方法有透析与超滤、 凝胶过滤法 、 离子交换层析法 、低温有机溶剂沉淀法等。 亲和层析法 (affinity chromatography)是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。