免 疫 亲 和 层 析

 

基 本 方 案 可 溶 性 或 膜 结 合 抗 原 的 分 离

材 料

抗 体（Ab)-Sepharose (单兀 12. 2)

活 化 的（对照）Sepharose填料，用于制 备 A b -Sepharose填 料（单 元 12. 2)，但去除了抗体或偶联时用无关抗体替代

细胞或匀浆的组织

T S A 溶液，冰预冷

裂解缓冲液，冰预冷

5 % (m /V ) 脱 氧 胆 酸 钠（Na-D O C ，过滤除菌并室温保存）

洗涤缓冲液

VTris/Triton/NaCl 缓冲液， p H 8.0 和 p H 9.0，冰预冷 lmol/L Tris • Cl， p H 6. 7 ，冰预冷

层析柱储存液，用冰预冷

层析柱

超速离心机

quick-seal 离 心 管（Beckman)

注 ：包含抗原的所有步骤都必须在4°C 冷室或冰浴中进行。

1.制备一个A b -Sepharose亲 和 层 析 柱（如 5m l ; 每 毫 升 Sepharose填 料 可 结 合 5m g 抗体）和 一 个 活 化 的（对照）Sepharose预 柱（如 5m l 的装载柱体积偶联或不偶联无关的抗体），并将它们串联起来（图 12. 1.1)。为了流速最大化，最好使用比较粗的层
析柱，将 Sepharose填料填充至柱内，柱高不要超过柱直径的2 倍 。装 载 5 ml Sepharose填料时可采用10〜20m l 的注射器。

2 . 将 50 g 细胞冰预冷T S A 溶液悬浮成浓度为I X l O ⁸〜5 X 10⁸⁷个细胞/m l 的悬液，或每一收集细胞或勻浆的组织体积加入1〜5 倍体积的冰预冷的 T S A 溶 液 。并加入等体
积的冰预冷的裂解缓冲液，在 4°C 搅 拌 lh。

对于糖基磷脂酰肌醇（GPI) 锚定蛋白质，在 20°C赙 育 IOmin可利于蛋白质的有效溶解。

3.4°C ， 4000 g 离 心 IOmin去除核酸，倒出上清液并保存。

4 . 对于纯化膜抗原，加 入 0.2倍 体 积 的 5 % Na-D O C 至去除核酸的上清液中， 4°C 或冰浴 IOmin后 ，转移至quick-seal离心管， 4°C ， 100 OOOg离 心 lh，小心取出上清液保存备用。

5 . 将 Sepharose预柱与亲和层析柱连接好（图 12. 1.1)利用下列溶液清洗这两个层析柱：

1 0 柱 体 积（column volume， C V ) 洗涤缓冲液

5CVTris/Triton/NaCl 缓冲液， p H 8.0

5C V T H S/Triton/NaCl 缓冲液， p H 9.0

5C V 三乙醇胺溶液

5C V 洗涤缓冲液。

6 . 将 步 骤 3 或 步 骤 4 的 上 清 液 上 样 到 预 柱（保留部分样品用于下述步骤1 2 的分析），并 以 5C V / h 的流速流经两个层析柱。每 1/10〜1/100上样体积时，收集流穿组分。流速可通过静水压力调节，最大可达到250 cm/h (图 12. 1,1)。通常上样两天对层析柱没影响，但如果上样持续时间较长，则表明层析柱阻塞或裂解液黏性太大，
后者通常是由于存在D N A 。

7 . 用 5C V 洗涤缓冲液清洗层析柱，然后关闭两个层析柱的开关，将预柱与亲和层析柱连接拆开。打开亲和层析柱的开关，使得层析柱顶端的液体排出柱体，保留柱子清洗时的所有组分。

8 . 每次变换缓冲液时要按下述步骤清洗免疫亲和层析柱（步 骤 9〜11)。关闭层析柱的开关，打开层析柱底部的螺帽。将一注射器与缓冲液槽出口端的管道相连，抽吸出管道中的缓冲液，将管子置于另一缓冲液槽，用注射器抽吸，使得管道中充满缓冲液 ，然后移去注射器。将管子弯曲折叠从而调控流速，并用缓冲液清洗层析柱的内壁 。打开层析柱开关，使得缓冲液流入层析柱。将底部螺帽松松地扣在层析柱上，使得缓冲液流经层析柱几厘米后，旋紧螺帽，开始清洗或洗脱。

9 . 用 5C V 的洗涤缓冲液清洗层析柱，先 是 Tris/Triton/N a C l 缓冲液， p H 8 . 0 , 然后是Tris/Trkon/N a C l 缓冲液， p H 9.0。检测最后一次清洗的组分，从而确定非特异性结合或从一些单克隆抗体上解离的蛋白质的洗脱状况。

10.用 5C V 三乙醇胺溶液洗脱抗原，收集洗脱组分，并 将 1 体积洗脱液放入0.2体积的lmol/L Tris • C U p H 6. 7 溶液中。

理想的三乙醇胺溶液的p H 可 使 得 配 体 完 全 解 离（无活性损失），这可通过用SDS——P A G E 分 析 20ul洗脱后的层析柱填料（Ab-Sepharose) 和 50^1洗脱液得以确证。

11.用 5C V T S A 溶液清洗层析柱。为了避免层析柱干掉，用 T S A 溶 液 4°C 保存层析柱以备用。

12.利 用 S D S - P A G E (单元12. 3 ) 和 银 染（单 元 12. 4 ) 分析每一 50M1洗脱组分是否含有抗原。通 过 A b -Sepharose利用免疫沉淀法分析(X 5〜I m l 样品和代表性的流穿及洗涤组分，然后再进行SDS-P A G E 和银染从而确定层析柱是否饱和。

如果洗脱过程中，抗体从填料上脱落，利 用 protein A -Sepharose可去除洗脱液中 的 抗 体（Ey M a L , 1978)。即使是结合力较弱的小鼠I g G l 亚群在p H 8 的条件下也 能 去 除 掉（M . Dustin， pers. C o m m .)

当利用辛烷基P-D -葡糖苷或脱氧胆酸钠作为去垢剂时，可测定A 28。值对各组分进行初步分析。

备 选 方 案 1 抗 原 低 pH 洗脱

附 加 材 料

磷酸钠缓冲液， p H 6. 3

甘氨酸缓冲液

lmol/L Tris • Cl, p H 9. 0

1 . 制备层析柱和裂解液，清 洗 层 析 柱 并 分 离 抗 原（见 基 本 方 案 步 骤 1〜 9 , 用 Tris/Triton/N a C l 缓冲液、 p H 8. 0 彻底清洗层析柱）。进行酸洗脱之前需去除脱氧胆酸钠，因为脱氧胆酸钠在低p H 过 渡 到 中 性 p H时，会形成沉淀或胶体。

2 . 用 5C V 的磷酸钠缓冲液、 p H 6. 3 清洗层析柱。

3 . 用 5C V 的 甘 氨 酸 缓 冲 液 洗 脱 抗 原 。将 洗 脱 组 分 收 集 到 含 0 . 2 倍 体 积 的 lmol/LTris • C U p H 9.0溶液的试管中，收集后立即混匀每一组分。

4 . 分析各组分是否含有抗原（见基本方案，步 骤 12)。

备 选 方 案 2 用 辛 烷 基 P-D-葡糖苷洗脱抗原

附 加 材 料（其他材料见基本方案)

辛烷基β-D -葡糖苷

1 . 制备层析柱和裂解液，清 洗 层 析 柱 并 分 离 抗 原（见 基 本 方 案 步 骤 1〜 9 , 用 Tris/Triton/N a C l 缓冲液， p H 8. 0 彻底清洗层析柱）。

2 . 用 5C V 含 1 % 辛烷基β-D-葡糖苷的T S A 溶液洗涤层析柱。

3.用 5C V 含 0 •l%Triton X -IOO 替 代 1 % 辛 烷 基 β-D -葡糖苷的三乙醇胺溶液洗脱抗原。

4 . 收 集 I C V 的洗脱液至含有 0 •2C V lmol/L Tris • C U PH 6. 7 的试管中。

5 . 清洗层析柱并分析各组分（见基本方案，步 骤 11〜12)。