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    免 疫 印 迹 和 免 疫 检 测

    相关实验：蛋白质分离和分析

    最新修订时间：

    原理

     


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    材料与仪器

    步骤

    基 本 方 案 1 液体容器中的蛋白质印迹

    材 料

    待分析样品

    标准分子质量蛋白质，预 染 型（Sigma 或 Bio-Rad) 或 生 物 素 化 型（Vector labs 或Sigma)

    转移缓冲液

    无粉手套

    Scotch-Brite 垫 片（3M ) 或类似海绵

    Whatman 3M M 滤纸或类似物

    转 移膜：0.45um 硝 酸 纤 维 素 膜（Millipore 或 Schleicher& Schuell)， P V D F 膜(Millipore Immobilon P ) ，中 性 尼 龙 膜（Pall Biodyne A )，或者正电荷尼龙膜(Pall Biodyne B ; Bio-Rad Zetabind)

    电 印 迹 装 置（E C 装置， Bio-R a d 或 Hoefer)

    不可擦拭圆珠笔或软笔芯铅笔

    1.准备抗原样品，用小型或标准大小单向或双向凝胶分离蛋白质，上样时将预染的或生物素化的标准分子质量蛋白质上一道或多道。

    2.电 泳 结 束 后 ，拆 除 凝 胶 板 去 除 上 层 胶 ，在 室 温 下 用 适 量 转 移 缓 冲 液 将 凝 胶 平衡 30 min。

    3 . 准备一个足够大的盘置放塑料转移盒，盘中注满转移缓冲液将盒覆盖。

    4 . 按 照 图 12. 5.1 所 示 ，在塑料转移盒的底部一边放置 Scotch-Brite 垫片或海绵，再放上一张用转移缓冲液润湿的与凝胶同样大小的滤纸，在滤纸上放上凝胶，用试管轻轻地在凝胶表面卷动以赶走凝胶和滤纸之间的气泡。

    5 . 剪一张两边缘比凝胶宽 1〜2m m 的转移膜，将硝酸纤维素膜和尼龙膜呈 45°角慢慢放
    图 12. 5 . 1 液体容器中的蛋白质印迹含蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶平放在滤纸上。在凝胶上方放置 比凝胶略大1〜2mm的硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，再于膜上覆盖一层滤纸。然 后 用Scotch-Brite夹 住上述膜层，放入一塑料支持物中。然后将上述完整的装置放人含有转移缓冲液的容器中。要转 印带负电荷的蛋白质，将膜朝向阴极。要转印带正电荷的蛋白质，将膜面朝向阳极。带电荷的蛋 白质可以从凝胶上电转移到滤膜上。电转移可以使用100V 、 1〜2h 或 采 用 14V 转移过夜。 入蒸馏水中，让水把膜表面全部润湿（膜放入水中时不能太快，以免有气泡形成并 在膜上会形成白色斑点，阻碍蛋白质转移），将 P V D F 膜 放 入 100% 甲 醇 中 1〜2s， 用转移缓冲液平衡10〜15min。 6. 将凝胶表面用转移缓冲液湿润，将预湿润的膜直接置于凝胶上面（阴极一面），并按 步 骤 4 的方法赶走气泡。 7. 将另一张Whatman 3M M 滤纸润湿，置于膜的另一侧，赶走气泡，并在其上放置另 一 块 Scotch-Brite垫片或海绵，将塑料转移盒的顶部一边放好，完成组装。 8. 将盒中注入转移缓冲液盖没电极板，但不要碰到塞子基部，将此盒放入转移装置中， 膜向阴极一侧，根据阴极和阳极接上对应的电极。 9 . 通 电 ，在 I O O V 情况下转移需30min〜lh，并需在冷水循环中进行，或 者 以 14V (恒 电压）在冷室转移过夜。 10. 关闭电源并拆下装置，取出膜并在膜上剪一小三角标记样品顺序或者用软笔芯铅笔 或不可擦拭圆珠笔进行标记。 11. 用考马斯亮蓝以鉴定转移效率，如有必要的话，将硝酸纤维素膜或P V D F 膜可逆染 色 ，显 示 转 移 蛋 白 质 （见辅助方案1 ) ; 或者用考马斯亮蓝、印度墨水、萘酚蓝、胶 体金不可逆染色。 12. 可将膜干燥后置于密封塑料袋中4°C 保 存 达 1 年 。在进一步处理之前，将湿润的 P V D F 膜在少量1 0 0 % 甲醇溶液中浸泡并用双蒸水洗去甲醇。 13. 接着做免疫探针和蛋白质可视检测（见基本方案2、 3 和备选方案3)
    备 选 方 案 1 半干胶系统蛋白质印迹 参 照 图 12. 5. 2。 ( 3 >阴极 缓冲液浸湿的滤纸 凝胶 滤膜 缓冲液浸湿的滤纸 cellophane隔离层 凝胶 缓冲液浸湿的滤纸 缓冲液浸湿的滤纸 Mylar支持膜 ( J ) 阳极 •转印单元 j 转印单元 图 1 2 . 5 . 2 半干胶转移系统通常，下方为阴极，一次转移一块膜。在 阴 极上方放置一块Mylar衬 垫 ，然后在其上方依次放置三层预先用转移缓冲液浸泡的滤纸、硝 酸 纤 维 素 滤 膜 或 尼 龙 膜 、凝 胶 ，最后再放置三层预先用转移缓冲液浸泡的滤纸。如果转移多块凝胶，每个转印单元可依上述 顺序叠放，转印单元之间采用一层多孔cellophane膜 。要转印带正电荷的蛋白质，将膜面朝向阳 极 。电 转 移 采 用 最 大 电 流 为 〇 .8mA/cm2，即 对 于 8cmX10cm胶 和 McmXUcm胶可分别采用 60mA 和 200mA 转 移 。 其 他 材 料 （其 他 材料 见基 本 方 案 1) 6 张 Whatman 3M M 滤纸或类似物，剪成与凝胶相同大小，并用转移缓冲液浸泡 半 干 转 移 装 置 （Hoefer， Bio-R a d 或 Sartorius可选） 1, 准备样品，用小型或标准大小单向或双向凝胶电泳分离蛋白质。见 表 12. 5.1半干印 迹指示
    2 . 准 备 转 移 膜 （见基本方案1 ，步 骤 5)。 3 . 拆除凝胶装置，弃去浓缩胶。 4 . 将剪至与凝胶相同大小的、并用转移缓冲液湿润的三张滤纸置于阳极之上。如果 蛋白质直接转移至膜上，早 需 使 用 C A P S 缓 冲 液 ，因 为 甘 氨 酸 会 对 这 个 步 骤 有 干 扰 。 5 . 将平衡的转移膜置于最上层滤纸上，用试管轻轻地在膜表面滚动以赶走转移膜和滤 纸间的气泡。 6 . 将凝胶置于膜上，用试管轻轻地在膜表面滚动以赶走凝胶和转移膜间的气泡，保证 凝胶与转移膜间紧密接触。 7 . 将另外三张滤纸置于凝胶上，并赶走气泡。若同时转移多块凝胶，可在各转移层中 间加入一张用转移缓冲液平衡的多孔玻璃纸或透析膜。 8 . 将电极置于转移层上，小心连接电源。加 上 恒 电 流 （<〇 .8m A /c m 2 凝胶面积）开始 转移膜，时 间 为 l h 。若 出 现 过 热 （温度>45°C ) 现象，可适当降低电流。 9 . 转移结束后，关闭电源，拆去半干转移装置，取出膜用不可擦拭笔进行标记，继续 染 色 和 免 疫 检 测 （见基本方案1，步 骤 11〜13)。 辅 助 方 案 1 转移蛋白的可逆染色 为了鉴定蛋白质的转移效率，可将硝酸纤维素滤膜或 P V D F 膜进行可逆染色，而 尼龙膜不可用此方法。 材 料 （带 V 项 目 见 附 录 1) V 丽春红染色液 1.将蛋白质转移至硝酸纤维素滤膜或P V D F 膜 上 ， （见 基 本 方 案 1 或 备 选 方 案 1)，室 温下将膜置于丽春红S 染 液 中 5m i n 。 2 . 用 双 蒸 水 脱 色 2m i n ，如 有 必 要 ，用 不 可 擦 拭 笔 将 标 准 分 子 质 量 M a r k e r 条带划线 标记。 3 . 再用双蒸水脱色lO m i n，使膜完全脱色。 基 本 方 案 2 采用二抗检测的免疫探针法 材 料 （带 V 项 目 见 附 录 1) 完成蛋白质转印的膜（见基本方案1 或备选方案1) V 膜封闭液 目的蛋白特异性一抗 V T T B S (硝酸纤维素滤膜或P V D F 膜）或 T B S (尼龙膜） 二抗结合物：辣 根 过 氧 化 物 酶 或 碱 性 磷 酸 酶 标 记 的 二 抗 （Cappel，Vector labs， Kirkegaard & P e r r y或 Sigma)，按需要稀释并按每份25/xl分装冷冻保存 热密封的塑料袋或塑料孵育盒 无粉手套
    塑料盒 1 . 如 ( 1〜3 张 14c m X 14c m ) 膜置于盛有5m l 封闭液的密封塑料袋中，室温下在摇床上 鮮 育 30〜60m i n 。 若需要将膜上抗体解离并重新标记的话（见 辅 助 方 案 3)，封闭液中需包含酪蛋 白 （碱性磷酸酶标记法）或者是使用脱脂奶粉。 2 . 用封闭液稀释一抗。 可以根据经验稀释一抗，但通常把多克隆抗体按1 : 1 0 0 0 稀 释 ，杂交瘤培养上 清 按 I : 10〜1 : 100稀释，把含有有单克隆抗体的杂交瘤腹水按1 : 1000稀释后使 用，大 于 1 : 10〜1 : 100倍稀释的一抗适用于碱性廣酸酶或焚光检测系统。一抗和 二抗都可至少使用两次，但不能长时间保存（如 在 4°C 不超过2d)。 3 . 倒出袋中封闭液，加 入 5m l 稀释的一抗，室温下摇床上孵育30m i n〜l h 。 当使用塑料盒时，一抗和二抗溶液需要25〜50m l ，若是使用单个条带的膜条， 可使用单独槽的孵育盘，每个槽中加入〇• 5〜I m l 的抗体稀释液。 4 . 戴手套后将膜从塑料袋中取出，置于塑料盒中，用 200ml T T B S (硝酸纤维素滤膜或 P V D F 膜）或 T B S (尼龙膜）洗 膜 4 次 ，每次摇床上孵育10〜IS m i n0 5 . 用封闭液稀释二抗（H R P 或 A K P 标记的二抗）。 一般商品化的酶标二抗稀释1 : 200〜1 : 2000。 6 . 将膜置于新的热密封塑料袋中，加 入 5m l 的 H R P 或 A K P 标记的二抗稀释液。室温 下在摇床上孵育30m i n 〜l h 。 7 . 将膜取出按步骤4 方法洗膜。显 色 观 察 结 果 （见基本方案3)。 备 选 方 案 2 亲和素-生物素化二抗的免疫探针法 附 加 材 料 （其 他 材 料 见 基 本 方 案 2 ， 带 V 项 目 见 附 录 1) V 膜和检测用封闭液 V T T B S (硝酸纤维素滤膜或P V D F 膜）或 T B S (中性或带正电荷的尼龙膜） VectastainABC (H R P ) 或 A B C - A P (A P ) 试 剂 盒 （V e c torLabs) 包 含 ：试剂 A (亲和素），试 剂 B (生物素化的H R P 或 A P ) ; 生 物 素 化 二 抗 （附使用手册） 1 . 将膜放人热密封塑料袋中，加入适量的封闭液，摇床孵育平衡膜。硝酸纤维素滤膜 和 P V D F 膜室温下孵育30〜60m i n ，尼 龙 膜 37°C 赙 育 2h 以上。 由于在脱脂奶粉中含有残留生物素，会干扰免疫试验，所以只能在封闭液中使 用 ，若膜上抗体要解离并重新标记，封 闭 液 中 需 含 有 酪 蛋 白 （A P 系统）或脱脂 奶粉。 2 . 用 T T B S (硝酸纤维素滤膜或P V D F 膜）或 T B S (尼龙膜）稀释一抗，制备一抗稀 释液。 含一抗的血清通常稀释1 •• 100〜1 : 100 000。对高灵敏度生物素-亲和素系统而 言，通常使用1 : 1000〜1 : 100 000。如 果 使 用 A P 或焚光检测系统，可采用更高的 稀释倍数。 3 . 打开密封袋，弃去封闭液，加入足够量一抗溶液将膜覆盖，室温下在摇床上匀速振
    荡 孵 育 30m i n 。 4 . 将膜从密封袋中取出放入塑料盒中，用 T T B S (硝 酸 纤 维 素 滤 膜 或 P V D F 膜 ）或 T B S (尼龙膜）洗膜三次，每 次 15m i n 以上。 T T B S 或 T B S 加入的量以完全覆盖膜 为 宜 （如每个膜条加5〜I O m l 或整块膜加50m l )。 5 . 稀释生物素化二抗溶液，将两滴生物素化二抗加入50〜100ml T T B S (硝酸纤维素滤 膜 或 P V D F 膜）或 T B S (尼龙膜）中。 6 . 将膜转移至加有二抗的新塑料袋中，室 温 下 缓 慢 振 荡 孵 育 30m i n 。然 后 按 步 骤 4 洗膜。 7 . 当膜与二抗孵育时，准 备 H R P 或 A P 亲和素-生物素结合物。将 两 滴 Vectastain试 剂 A 和 两 滴 试 剂 B 加 入 T T B S (硝 酸 纤 维 素 滤 膜 或 P V D F 膜 ）或 T B S (尼龙膜） 中，室温下孵育30m i n 后 ，加 入 T T B S 或 T B S 至 50m l 。 8 . 将膜转移至上述含H R P 或 A P 亲和素-生物素结合物的溶液中，室温下缓慢振荡孵 育 30m i n 后 ，按 步 骤 4 法 洗 膜 30m i n 以上。 9 . 使用合适方法将膜显色（见基本方案3)。 基 本 方 案 3 生色底物显色 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 转移有蛋白质并标记抗体-酶复合物的膜（见基本方案2 或备选方案3) V T B S 显 色 液 （表 12. 5. 2) 1. 若膜是用 T T B S 洗 涤 （见 基 本 方 案 2 , 步 骤 7 或 备 选 方 案 3 , 步 骤 8)，在室温下用 50ml T B S 洗涤 15m i n 。 2 . 加入显色液，孵 育 10〜30m i n 。 3 . 用水洗膜终止显色反应或发光反应，置于空气中干燥， 成像以长期保存实验结果。 表 12. 5. 2 显 色 系 统 和 可 见 光 检 测 体 系 系统 试剂b 反应/检测 评价 显色剂 HRP标记 4CN 氧化形成紫色沉淀 灵敏度低（ Tween 2 0 影响反应）； 曝光后迅速失效 DAB/NiCl^ 形成榇黑色沉淀 比 4CN灵敏度高，易致癌膜容易显色 TMBd 形成紫黑色沉淀 比 DAB法稳定性高，毒性低; 由于灵敏度高，可 适 用 于 各 种 类 型 的 膜 ，可 从 Kirkegaard& Perry, TSI5 Moss, Vector Labs购买 AP标记 BCIP/NBT 经 NBT氧 化 后 BCIP水解 比其他AP 沉 淀 底 物 灵 敏 度 高 ，更 可 靠 ，磷 生 成 靛 青 色 沉 淀 ，减 少 NBT沉淀 酸盐阻碍AP活性 氨基苯二酰肼 产生暗蓝灰色染色物 非常方便，灵敏度髙
    系统 试剂b 反应/检测 评价 发 光 系 统 HRP标记 AP标记 ，碘酚 1 ，2-二 氧 环 乙 烷 磷 酸 衍 生 物 （如 AMPPD、 CSPD, Lumigen-PPD、 Lumi-Phos 530)6 蓝光，P-碘酚增强蓝色荧光 去磷酸化后底物发光 检测时间可为几秒至Ih 所有类型的膜均适用，为取得最大灵敏度和 最少背景，可向生产商咨询 a. 缩 略 ： AMPPD或 IwnigenPPD; AP: 碱 性 磷 酸 酶 ； BCIP: 5-溴-4-氯-3-吲 哚 磷 酸 ； 4CN: 4-氯-1-奈酚; DAB: 二氨基联苯胺； HRP: 辣根过氧化物酶； NBT: 四唑氮蓝； TMB: 四甲基联苯胺。 b. 试剂用法见附录1 ， TMP用法见试剂盒说明书。 c. DAB/NiCl2 可 以 不 用Ni2+ 强化，但灵敏度会降低。 d. McKimm-Breschkin (1990)指出，若硝酸纤维素滤膜用10mmol/L 柠 檬 酸 EDTA (PH5 . 0 ) 和葡聚糖磷酸 酯 处 理 lOrnin，则 TMB的灵敏度高于4CN和 DAB，> BCIP/NBT的灵敏度。 e. Lumi-Phos 530 中包含 dioxetane phosphate、 M g d CTAB 及焚光増强剂， pH9. 6 。 备 选 方 案 3 生色底物显色 附 加 材 料 （其 他 材 料 见 基 本 方 案 3 ) 显色底物缓冲液： 50m m 〇l/L T ris/H C l ， p H 7.5 (附 录 1 ，适 用 于 H R P 系统），或 二氧烷磷酸酯底物缓冲液（附 录 1 ，适 用 于 A P 系统） Nkro-Block 溶 液 （只适用于 A P 系统）： 5 % (V 7 V ) Nitro-block (Tropix) 二氧烷 磷酸酯底物缓冲液混合液，使用前新鲜配制 发 光 显 色 液 （表 12. 5, 2) 干净的塑料袋 1 . 用 50m l 发光底物缓冲液将膜平衡两次，每 次 15m i n 。 2. A P 反 应 使 用 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 或 P V D F 膜 ，将 膜 在 50ml N kro-Block溶液中孵育 5m i n ，然 后 用 50m l 底物缓冲液孵育5m i n 。 采 用 Lumi-phos 530 试 剂 显 色 不 需 要 此 步 骤 ， 尼 龙 膜 上 的 A P 反 应 或 任 何 类 型 膜 的 H R P 反 应 不 需 要 Nitro-Block 溶 液 处 理 。 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 显 色 不 使 用 Lumi-Phos 530 试 剂 。 3•将膜转移至50m l 发光显色液中，浸 泡 30s (H R P 反应）或 5min (A P 反应）。 4 . 取出膜，干燥后将膜的蛋白质转印面朝下置于一张干净的塑料包裹纸上，将包裹纸 折叠后，用显色液浸没膜。 5 . 在暗室中，将膜蛋白面朝下置于成像仪中，成像几秒至几小时。 6 . 若有必要，将 膜 用 50ml T B S 洗涤两次，每 次 15m i n ，接着进行生色显色（见基本方 案 3)

    来源：丁香实验

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