Poly（A）＋RNA的分离纯化

 

1）      Poligo(dT)- 纤维素层析法提取 poly(A)⁺ RNA

 

装柱与填柱

 

1.      取 oligo(dT)- 纤维素 0.5 ～ 1.0 g ，用 0.1 mol/L NaOH 重悬。

2.      用 oligo(dT)- 纤维素（ 0.5 ～ 1.0 ml 柱体积）灌注 DEPC 处理过的一次性柱子（或塞以无菌玻璃毛的巴式滴管， 300 ℃烘烤灭菌 4 h ）。用 3 倍柱体积 DEPC 处理过的水洗涤柱子。

3.      用无菌的 1 ×装柱缓冲液（用无菌的 DEPC 处理过的水稀释 2 ×的贮存液）洗涤柱子，直到流出液的 pH 值＜ 8.0 。用 pH 试纸测试。

4.      用双蒸灭菌的水溶解 RNA ， 65 ℃， 5 min 处理溶液。将溶液快速冷却到室温，并加入 1 倍体积的 2 ×装柱缓冲液。

 

 

柱上 poly(A)⁺ 的恢复

 

5.      将 RNA 溶液加到柱上，并立即用无菌的管子收集流出液。当所有的 RNA 溶液进入柱子时，用 1 倍体积的 1 ×装柱缓冲液洗柱，继续收集流出液。

6.      当所有的液体流出柱子后， 65 ℃加热收集液 5 min ，重新加到柱子中。再次收集流出液。

7.      用 5 ～ 10 倍柱体积的 1 ×装柱缓冲液洗涤柱子，用无菌塑料管（如微量离心管）收集 1 ml 洗涤液。

8.      按 1 ： 20 比例稀释各部分收集液，用石英杯或处理过的异丁烯杯测量 260 nm 出的吸收值，以 1 ×装柱缓冲液作为空白对照。

9.      将包含大多数 OD₂₆₀ 物质的部分用 2.5 倍体积的乙醇沉淀。

 

 

从柱中洗脱 poly(A)⁺ RNA

 

10.  用 2 ～ 3 倍柱体积的无菌、无 RNA 酶的洗脱缓冲液从 oligo(dT)- 纤维素柱上洗脱 poly(A)⁺ RNA 。收集相当多于 1/2 ～ 1/3 柱体积的流出液。

11.  用石英杯或处理过的异丁烯杯测量各部分收集液在 260 mn 处的吸光值。混合包含洗脱 RNA 的部分。

 

 

RNA 的进一步纯化（可选）

 

经过一轮 oligo(dT)- 纤维素柱的层析得到的物质通常会包含大约相同数量的多聚腺苷酸和不含多聚腺苷酸的 RNA ，可以按下面的步骤进一步纯化。

12.  为进一步纯化 poly(A)⁺ RNA ， 65 ℃加热准备的 RNA 3 min ，然后迅速冷却到室温。用 5 mol/L NaCl 调整洗脱 RNA 中的 NaCl 浓度至 0.5 mol/L ，在同一个 oligo(dT)- 纤维素柱上进行第二轮层析（重复步骤 3 和 5 ～ 11 ）。

13.  对于第二轮 oligo(dT)- 纤维素柱层洗脱下来的 poly(A)⁺ RNA ，加入 3 mol/L 的乙酸钠（ pH5.2 ）至终浓度 0.3 mol/L 。混合均匀。加入 2.5 倍体积冰冷的乙醇，混合，将该溶液置于冰上至少 30 min 。

14.  在 10 000g （相当于 Sorvall SS-34 转子 9000 r/min ）， 4 ℃下离心 15 min 。小心弃掉上清，用 70% 乙醇洗涤沉淀（通常是不可见的）。稍做离心，吸出上清，将敞口的管子倒置几分钟，使大部分剩余酒精蒸发。不要使沉淀干燥。

15.  重新将潮湿的 RNA 沉淀用小体积的无菌、 DEPC 处理过的水溶解。用石英杯或处理过的异丁烯杯测量每一部分柱子收集液在 260 nm 处的吸光值。将含有 RNA 的部分混合。

16.  保存制备好的 poly(A)⁺ RNA 。

 

 

2）      批量层析方法筛选 poly(A)⁺ RNA

 

1.      在一系列灭菌微量离心管中，将每份总 RNA （上限为 1 mg ）样品的体积用 TES 调整到 600 μ l 。封好管口，在 65 ℃加热 10 min ，然后迅速在冰上冷却到 0 ℃。每份样品加 75 μ l （ 0.1 倍体积） 5 mol/L NaCl 。

2.      在每管中加 50 mg (500 μ l) 平衡的 oligo(dT)- 纤维素，盖好管盖，室温下旋转轮上温育 15 min 。

3.      用微量离心机在室温下离心， 600 ～ 800 g （约 1500 ～ 2500 r/min ）， 2 min 。

4.      将上清移到一系列干净的离心管中，置冰上存放。

5.      在含 oligo(dT) 的沉淀中加 1 ml 冰预冷的吸附 / 洗涤缓冲液。温和旋涡震荡分散沉淀。将盖好盖子的离心管置于旋转轮上，室温下温育 2 min 。

6.      室温下，用微量离心机离心， 600 ～ 800 g 约 1500 ～ 2500 r/min ）， 2 min 。弃上清。重复步骤 5 和 6 两次。

7.      在含 oligo(dT) 的沉淀中加 0.4 ml 冰预冷的双蒸灭菌水，温和旋涡震荡以重悬沉淀。立即在微量离心机上离心， 4 ℃， 2 min 。

8.      小心吸去上清。

9.      回收结合的 poly(A)⁺ RNA ：用 400 μ l 双蒸灭菌水重悬沉淀，在 55 ℃温育 5 min ，然后 4 ℃离心 2 min 。

10.  将上清移至一系列干净的离心管中，重复步骤 9 两次，合并所有上清。

11.  在上清中加 0.2 倍体积的 10 mol/L 醋酸铵和 2.5 倍体积的乙醇，在 -20 ℃存放 30 min 。

12.  回收沉淀的 poly(A)⁺ RNA ： 4 ℃离心，最大速度， 15 min 。小心弃上清，用 70% 乙醇洗沉淀，短暂离心，吸去上清，将管盖打开，倒置数分钟，使大部分残留的乙醇挥发。

13.  用小体积灭菌的 DEPC 处理的水溶解 RNA 。

14.  估计 RNA 浓度。

15.  保存样品。（参照《分子克隆试验指南》第三版 518 页）