简介
树突状细胞（dendritic cell，DC）是一种贴壁细胞，它在脾脏贴壁细胞中所占的比例小于 1%，细胞轮廓不规则，具有树枝状的突起。DC 不但存在于脾脏等外周淋巴器官中，也存在于外周血中。为了在体外研究 DC 的功能，需要对体内的 DC 细胞（主要是外周血、脾脏、淋巴结）进行分离、纯化。分离纯化 DC 的方法主要有两种：基于细胞物理性状的分离方法（如贴壁法）和基于细胞表面标记的分离方法（如 MACS 和 FACS 分离法）。
原理
贴壁法人外周血树突状细胞的分离的基本原理是 DC 具有轻度黏附特性。在经过分离液处理培养一定时间（24 小时内）就自动从塑料平皿上脱落下来，而单核细胞和巨噬细胞可长时间黏附，借此可分离出 DC。
材料与仪器
试剂：
24 小时内获得的白细胞、RPMI 1640 培养液、HBSS、FBS、14.5% 的碘肽酰胺葡胺溶液、聚蔗糖-泛影葡胺溶液（Ficoll-Hypaque）、4℃ 预冷的 PBS。
仪器：
15 ml 和 50 ml 聚丙烯锥底离心管、100 mm 细胞培养皿、倒置显微镜。
步骤
人外周血树突状细胞贴壁法分离纯化的基本过程可分为以下几步：
（1）将新鲜的肝素化血样置于 50 ml 离心管中，加入等量 PBS。对于通过白细胞成分采集得到的白细胞，其血样与 PBS 以 1：4 比例稀释，混匀。
（2）用移液管吸取聚蔗糖-泛影葡胺溶液（每 10 ml 血样/PBS 混合液加入 3 ml 聚蔗糖-泛影葡胺溶液），伸入样品管底部，缓缓地将聚蔗糖-泛影葡胺溶液加入血样/PBS 混合液底部。18～20 ℃，GH-3.7 转头离心机 900 g 持续离心 30 分钟。注意启动时应缓慢加速。
（3）吸弃含血浆和大部分血小板的最上层，小心地将中层的单个核细胞移入新的离心管。加入适量（达到细胞层 3 倍体积的量）的 HBSS 洗细胞，18～20 ℃，400 g 离 10 分钟，弃上清。重复洗涤细胞后，用完全 RPMI 1640 调整细胞浓度为 1 x 10 个/ml。
（4）将单个核细胞悬液铺 100 mm 细胞培养皿中，每板 10 ml（≤ 1 x 10）。37 ℃ 孵育过夜。
（5）轻轻晃动培养皿，收集未贴壁细胞。沿皿壁向培养皿中加入预热的培养基，轻轻晃动培养皿，收取残留的未贴壁细胞。重复洗涤 3 遍。将所有的未贴壁细胞置于新的培养皿中孵育 30 分钟后，轻轻旋动培养板获取未贴壁细胞。若有需要可以重复一次。
（6）室温 200 g 离心，弃上清，用完全 RPMI1640 重悬细胞。计数并调整胞浓度为 1 x 10/ml。
（7）室温下，在 15 ml 锥底离心管中加入 4 ml 14.5% 的无菌碘肽酰胺葡胺溶液，将 8 ml 细胞悬液缓慢加在碘肽酰胺葡胺溶液上，形成一明显界面。室温 800 g 离心 10 分钟。注意缓慢加速。
（8）将无菌 Pasteur 吸管伸入培养基中，小心地收集液面交界处的细胞以及顶部约 1 ml 的碘肽酰胺葡胺。
（9）将细胞移入新的 50 ml 锥底离心管，加入至少 2 倍体积的预冷 PBS，轻柔混匀。
（10）450 g 离心 10 分钟。用完全 RPMI 1640 培养基洗涤细胞 2 次，锥虫蓝拒染法计数活细胞，用完全 RPMI 1640 培养基重悬并调整细胞浓度为 1 x 10 个/ml。
（11）再次将细胞悬液铺于 100 mm 细胞培养皿上进一步去除单核细胞，每板 10 ml 悬液。37 ℃ 孵育 1 小时。轻轻晃动培养板，收取悬浮细胞即为树突状细胞。
来源：丁香实验
