树突状细胞

树突状细胞(Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ,ＤＣ)是机体免疫系统中最强有力的一种专职的抗原呈递细胞(ＡＰＣ),在免疫应答的启动、调控上起着关键的作用[1]。现代抗肿瘤免疫疗法利用ＤＣ负载肿瘤相关抗原(ＴＡＡ)制成的肿瘤疫苗(瘤苗),在转移性前列腺癌、恶性黑色素瘤、多发性骨髓瘤和慢性髓性白血病(ＣＭＬ)等几种恶性肿瘤的治疗上已取得喜人的效果。现对树突状细胞的生物特性、来源、抗瘤机制、肿瘤疫苗疗法等进行综述。

1　ＤＣ生物学特性ＤＣ最初是Ｓｔｅｉｎｍａｎ和Ｃｏｈｎ等1973年从小鼠脾组织中分离发现的,因其形态具有树突样或伪足样突起而命名。

目前一致认为,凡具有典型的树突状形态,膜表面高表达ＭＨＣⅡ类分子,能移行至淋巴器官和刺激初始型Ｔ细胞增殖活化,并具有一些相对特异性表面标志的一类细胞,方能称之为ＤＣ。ＤＣ广泛分布于全身各脏器,数量极微,约占外周血白细胞总数的1%,ＤＣ的前体细胞由骨髓进入外周血,再分布到全身各组织。ＤＣ主要分为髓系ＤＣ(ｍｙｅｌｏｉｄｄｒｉｖｅｄＤＣ)和淋巴系ＤＣ(ｌｙｍｐｈｏｉｄｒｅｌａｔｅｄＤＣ)两大类。

成熟的ＤＣ表现出主要特征:

(1)细胞形态不规则,表面有许多膜样或树突样突起;

(2)细胞表面具有丰富的有助于抗原提呈的分子,如持续、高水平的表达ＭＨＣⅠ类、Ⅱ类分子,共刺激分子ＣＤ80(Ｂ71)和ＣＤ86(Ｂ72),细胞粘附分子ＣＤ11ａ(ＬＦＡ1),ＣＤ11ｃ,ＣＤ50(ＩＣＡＭ2),ＣＤ54(ＩＣＡＭ1),ＣＤ58(ＬＦＡ3)和ＣＤ102(ＩＣＡＭ2),以及淋巴细胞功能相关抗原ＬＦＡ1、ＬＦＡ3等。人血中的ＤＣ前体开始表达ＣＤ2,4,13,16,32,33,但随着成熟渐渐失去表达,而粘附分子、共刺激分子、ＭＨＣ抗原随着成熟而表达增加[2]。活化后,特别是ＣＤ40Ｌ活化后,ＣＤ80、ＣＤ86上调。在成熟中,ＣＤ86出现早,而ＣＤ80出现晚,血中ＤＣ前体几乎不能检测到[3,4]。

(3)在混合淋巴细胞反应中,既能激活ＭＨＣ相同的自身反应性Ｔ细胞,又能激活ＭＨＣ不同的同种反应性Ｔ细胞,而其最大特点是能够显著刺激初始型Ｔ细胞(ＮａｉｖｅＴｃｅｌｌ)增殖并建立初级免疫应答。

(4)具有向局部淋巴细胞Ｔ细胞区迁移的能力。

(5)ＤＣ激发Ｔ细胞增殖及抗原提呈能力是巨噬细胞和Ｂ细胞的100～1000倍[5]。

新近发现的ＤＣＳＩＧＮ(ＤＣｓｐｅｃｉｆｉｃＩＣＡＭ3ｇｒａｂｂｉｎｇｎｏｎｉｎｔｅｇｒｉｎ)分子在启动静息Ｔ细胞免疫反应中的作用引起人们的注意,ＤＣＳＩＧＮ是ＤＣ特异表达的、第一个被鉴定的ＤＣ限制性分子,介导ＤＣ与静息Ｔ细胞的强烈粘附从而发挥ＤＣ诱导的Ｔ细胞增殖作用[6,7]。

另外,在体内外,ＤＣ具有与其他ＡＰＣ不同的功能特征,可递呈抗原给静息Ｔ细胞的能力是ＤＣ最重要的功能之一,其能力是其他ＡＰＣ的10～100倍。正是由于ＤＣ的上述特征使其成为体内抗原提呈能力最强的ＡＰＣ,也是唯一一类可直接活化静息Ｔ细胞的ＡＰＣ。

2　树突状细胞的来源

近几年来,随着人们在ＤＣ的起源、分类、摄取和加工处理抗原的机制以及引起ＤＣ迁移和成熟的信号传导等领域研究的深入,有关人ＤＣ大量培养和扩增的方法日益成熟。目前,树突状细胞有三个来源:骨髓、外周血和新生儿脐带血。从骨髓中分离获得树突状细胞的ＣＤ+34的祖系细胞,或从外周血或新生儿脐带血于体外经14ｄ培养分化(在ＧＭＣＳＦ和ＴＮＦａ存在的情况下)成为成熟的ＣＤ+1ａ、ＣＤ+83、ＨＬＡＤＲ的树突状细胞;或者用外周血纯化的ＣＤ+14单核细胞或粘附单核细胞在二种细胞因子(ＧＭＣＳＦ和ＩＬ4或ＩＬ13)的培养刺激下成为ＣＤ+1ａ、ＣＤ+83的未成熟树突状细胞,再经ＴＮＦａ或(和)ＣＤ40Ｌ刺激形成成熟的树突状细胞。

3　树突状细胞抗肿瘤的分子机制研究证明[8],树突状细胞与肿瘤的发生、发展具有以下密切关系。

(1)以肿瘤抗原体外专一性地冲击致敏、激活功能最强的ＡＰＣ树突状细胞,可保证肿瘤抗原被有效摄取。

(2)树突状细胞通过细胞表面高水平的ＭＨＣⅠ、Ⅱ类分子呈递了丰富的肿瘤抗原肽,使相应的Ｔ细胞受体(ＴＣＲ)被充分占据;同时,树突状细胞提供高水平的协同刺激分子Ｂ7 1(ＣＤ80)、Ｂ7 2(ＣＤ86)、ＣＤ40分子等,使Ｔ细胞被充分激活。

(3)树突状细胞与Ｔ细胞结合后,可以大量分泌ＩＬ12,激发Ｔ细胞增殖,诱导特异性细胞毒性Ｔ淋巴细胞(ＣＴＬ)生成,主导了ＴＨ1型的免疫应答,有利于肿瘤细胞的清除。(4)树突状细胞还能分泌趋化因子(ＤＣＣＣＫ),专一性地趋化初始型Ｔ细胞,通过促进Ｔ细胞聚集,增强对Ｔ细胞的激发。另外,肿瘤病人可以在中枢神经系统检测到Ｔ淋巴细胞和主要组织相容性抗原。采用细胞因子修饰的肿瘤细胞瘤苗能够产生抗中枢神经肿瘤的免疫反应,因此免疫反应可以介入中枢神经系统疾病。

4　关于各种类型的树突状细胞疫苗[9,10]目前已研究了各种形式肿瘤抗原体外冲击致敏树突状细胞制备的疫苗。

(1)细胞性肿瘤抗原:经放射线照射灭活的肿瘤细胞、肿瘤细胞反复冻融上清或肿瘤细胞冻融后膜碎片或超声破碎方法制备肿瘤细胞的蛋白提取物直接体内免疫后都只产生极弱的抗肿瘤免疫效应,已极少作为肿瘤疫苗单独用于临床。

(2)肿瘤抗原多肽:应用经弱酸洗脱肿瘤细胞表面的ＭＨＣⅠ类抗原多肽冲击树突状细胞,其靶向性更好,肿瘤抗原浓度更高,可产生“冲击致敏”的效应,促进Ｔ细胞有效激活。

(3)肿瘤抗原基因:将肿瘤抗原基因转移进树突状细胞,体内诱发特异性抗肿瘤免疫功能。其方式有多种:用脂质体介导单纯疱疹病毒(ＨＳＶ)蛋白抗原编码基因冲击树突状细胞,或脂质体介导酪氨酸酶基因转移入树突状细胞;用肿瘤细胞的ＲＮＡ作为抗原冲击树突状细胞,或用低免疫原性肿瘤的ＲＮＡ(总ＲＮＡ或ｐｏｌｙＡ+ＲＮＡ)冲击树突状细胞,免疫接种后可诱导出强烈抗肿瘤免疫力;用腺病毒载体介导肿瘤抗原基因对成熟树突状细胞的转染;用黑色素瘤抗原基因质粒通过基因枪技术转染体外培养的树突状细胞等。

(4)抗独特型抗体:抗独特型抗体是肿瘤抗原的内影像,可模拟肿瘤抗原被机体识别,激发针对肿瘤细胞的免疫功能。临床首例应用树突状细胞治疗肿瘤就是应用抗独特型抗体致敏树突状细胞来做为瘤苗。

(5)与细胞因子联合使用:ＩＬ12是体内介导ＴＨ1型应答的细胞因子,与抗原冲击的树突状细胞瘤苗联合应用于肿瘤治疗,收到更佳的抗癌效果。某些情况下甚至逆转由树突状细胞诱导的耐受。

肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原:粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子(ＧＭＣＳＦ)可以促进树突状细胞的成熟,维持树突状细胞的存活。

将ＧＭＣＳＦ基因经腺病毒载体介导转入树突状细胞,具有更强的体内激发肿瘤特异性ＣＴＬ的能力。用腺病毒将ＩＬ12基因转染树突状细胞,也可协同增强Ｔ细胞功能,促进机体的抗肿瘤效应。Ｆｍｓ样酪氨酸激酶Ⅲ(ＦＬＴ3,酪氨酸激酶受体家族Ⅲ成员之一)配体(ＦＬＴ3Ｌ)也是一种细胞因子,能与树突状细胞或Ｂ细胞表面的受体结合,促进树突状细胞的成熟,故也有人应用ＦＬＴ3Ｌ联合树突状细胞瘤苗增强抗肿瘤疗效[11]。

此外,曹雪涛等[12]还将重组腺病毒介导的ＧＭＣＳＦ基因转染的树突状细胞经肿瘤抗原冲击致敏后,与肿瘤细胞融合制备出免疫原性更强的新型瘤苗,他们还报道了肿瘤抗原多肽致敏的、淋巴细胞趋化因子基因修饰的树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫应答的实验结果。法国与意大利合作小组[13]发现,肿瘤抗原冲击的树突状细胞胞浆内形成许多包含抗原多肽的小体(ｅｘｏｓｏｍｅｓ或ｄｅｘｏｓｏｍｅｓ)。实际上,树突状细胞除了细胞间直接接触和通过分泌细胞因子起作用外,人和小鼠的树突状细胞均能分泌或外排ｅｘｏｓｏｍｅｓ,这种小体中不含凋亡小体、胞浆膜或内质网组组等,表达ＭＨＣⅠ、Ⅱ类分子和ＣＤ86,具抗原呈递能力,能在体外刺激抗原特异性ＣＤ+8Ｔ细胞的增殖,因而有诱导Ｔ细胞免疫反应的功能。从树突状细胞上清分离和纯化这些小体给荷瘤小鼠皮下注射(5μｇｅｘｏ ｓｏｍｅｓ)也诱导了极强的抗肿瘤效应,在体内诱导出高水平的ＣＴＬ,并能治愈荷瘤小鼠,提示作为无细胞体系诱导体内免疫功能的应用途径,ｅｘｏｓｏｍｅｓ也可以说是一种新型的亚细胞成分的树突状细胞瘤苗。

(7)直接应用ＤＣ:将ＤＣ在体外进行扩增后再回输体内,以求获得更多的ＣＴＬ,这本身就是一种过继性免疫治疗,而且大多数肿瘤组织内浸润ＤＣ的数量与肿瘤患者的预后直接相关,浸润ＤＣ多则预后好。

5　ＤＣ的输注途径和剂量输注途径早期ＤＣ的输注途径多采用静脉注射。

近年来,采用皮下、皮内、淋巴管内、瘤体内注射的方法得到了广泛的应用。目前,多数学者认为,皮内、瘤体内注射可能更有利于ＤＣ发挥其生物学功能。ＤＣ发挥其抗肿瘤免疫效应的基础是ＤＣ负载肿瘤抗原后,能够迁移至Ｔ淋巴细胞富集的二级淋巴器官,从而激活抗肿瘤免疫反应。因此,ＤＣ的输注途径与其能否更好地发挥生物学功能密切相关。

(1)静脉及淋巴管内注射:Ｍａｃｋｅｎｓｅｎ等[14]对ＤＣ的静脉及淋巴管内注射进行了比较,作者用转移性恶性黑色素瘤患者外周血ＣＤ+34造血干细胞来源的ＤＣ经放射性标记后,静脉或淋巴管内注射,γ照相机全身拍照观察。发现ＤＣ经静脉注射后在肺内作短暂停留,最后定位于脾和肝脏7ｄ以上;ＤＣ注入足背淋巴管内后,可迅速迁移至引流淋巴结并停留24ｈ以上,实验说明淋巴管内注射与静脉注射相比,更有利于ＤＣ发挥其抗肿瘤作用。

(2)真皮内注射:Ｔｈｏｍａｓ等[15]则比较了多种ＤＣ的输注形式后,发现真皮内注射ＤＣ后,10ｍｉｎ内就可见标记的ＤＣ迁移入引流淋巴结,4ｈ后引流淋巴结显象最明显,证实真皮内注射可以使ＤＣ快速迁移至引流淋巴结且可以滞留较长时间,说明真皮内注射可能是ＤＣ疫苗抗肿瘤治疗的另一较佳输注途径。

(3)瘤体内注射:目前,ＤＣ疫苗抗肿瘤治疗临床试验,大都采用肿瘤细胞抗原肽、肿瘤细胞溶解物或凋亡的肿瘤细胞先体外致敏ＤＣ,然后回输体内。

6　树突细胞瘤苗的剂量和用法一般用的方案是:致敏树突状细胞制成1×10⁶个细胞

0.5ｍｌ,注射用细胞悬液,每次剂量为1×106个细胞,每周1次,连续用4周,然后间隔2周,再次接种以增强免疫,总接种量为5×106个树突状细胞。研究认为ＤＣ注射的细胞数量与肿瘤缓解的时间成正比。但是否细胞数量越高,治疗效果越好,有无平台效应,细胞数量多少为最佳尚需进一步研究。7　展望树突状细胞加肿瘤抗原将会成为有效的肿瘤免疫基因治疗手段。由于ＤＣ疫苗能促进同种异体Ｔ细胞增殖的特性及其强大的抗原提呈功能,不仅能将抗原提呈给ＭＨＣⅡ类分子促进ＣＤ+4Ｔ细胞增殖,又能提呈给ＭＨＣⅠ类分子促进ＣＤ+8Ｔ细胞增殖,诱发机体强烈的细胞免疫应答;同时研究还发现,ＤＣ在体液免疫中也发挥重要作用,可直接参与调节Ｂ细胞的成熟和分化,刺激Ｂ细胞增殖产生大量的ＩｇＡ和ＩｇＭ,全面调动机体的抗肿瘤免疫力,在机体抵御恶性肿瘤中发挥重要作用。ＤＣ疫苗的初步临床试用也显示出了良好的疗效。该疗法可望成为肿瘤生物治疗的又一新兴手段。