树突状细胞的抗原提呈功能检测

树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前公认的体内功能最强大的专职抗原提呈细胞（professional antigen presenting cell，APC）， 在免疫应答的首要环节--抗原提呈过程中扮演着重要的角色，是唯一能够活化初始 Th 细胞的 APC，成为适应性免疫应答的始动者；同时，DC 也在诱导机体的免疫耐受中发挥重要作用。

在免疫稳定状态下，分布于外周非淋巴组织的 DC 处于非成熟状态，主要功能为识别和摄取抗原。与其功能相适应，非成熟 DC 表面表达低水平的 MHC II 类分子和共刺激分子，高表达一系列受体以便于识别与病原体相关的物质，包括多种 Toll 样受体（Toll like receptor，TLR），C 型凝集素如甘露糖受体、DEC205 等。一旦发生感染或组织损伤，非成熟 DC 就会向炎性部位迁移，摄取加工抗原，并释放大量的炎性因子，激发天然免疫应答，避免感染的扩散。

相应地，非成熟 DC 发生了一系列的变化，获得了成熟表型及功能：

① 丢失用于吞噬的受体；

② 高表达 MHC II 类分子和共刺激分子，包括 CD40、CD80 和 CD86；

③ 形态发生改变；

④ 启动抗原处理机制，包括溶酶体相关的膜蛋白（DC-LAMP）的水平增加。同时，成熟 DC 的趋化因子受体表达谱发生变化，CCR1、CCR5 和 CCR6 等的表达降低，而 CCR7 的表达会增高，从而促使 DC 从外周组织沿传入淋巴管迁移至邻近的次级淋巴组织，与初始 T 细胞相遇，诱导其活化并增殖成为抗原特异性的效应 T 细胞，从而启动免疫应答。因此，DC 在非成熟期和成熟期的表型和功能各不相同。

树突状细胞的抗原提呈功能检测的基本原理是 DC 是最重要的抗原提呈细胞，目前检测小鼠 DC 抗原提呈功能，最常用的体系是抗原特异性 TCR 转基因小鼠来源的 T 细胞，在该抗原存在的情况下与 DC 共孵育后检测 DC 增殖情况。

最常用的抗原特异性 TCR 转基因小鼠是 DO11.10 和 OT-I、OT-II 小鼠。其中，D011.10 小鼠为 BALB/c 背景，其 T 细胞携带 MHCI 类分子限制的、针对 OVA323 - 339 肽的转基因 TCR，这种 TCR 可以被抗体 KJ1 - 26 识别。而 OT-I 和 OT-II 小鼠为 B6 背景，T 细胞分别为 MHC-I 类和 MHC-II 类分子限制的，针对 OVA257 - 264 肽和 OVA323 - 339 肽的转基因 TCR，该 TCR 可以被抗 Va2 或 Vβ5 抗体识别。

利用此种 TCR 转基因小鼠来源的 T 细胞，可以检测 DC 通过 MHCII 类分子和 MHCI 类分子提呈抗原的能力。现在以利用 D011.10 小鼠来源的 T 细胞为例，介绍 DC 的抗原提呈功能的检测。该方法利用流式细胞仪进行检测，步骤简单、省时，克服了以往检测 T 细胞增殖采用 MTT 法或 3 H-TDR 掺入法中 MTT 法灵敏度低、同位素标记易造成污染的缺点。

试剂：

（1）DO11.10 小鼠；

（2）DC 细胞；

（3）OVA 17 肽；

（4）包被磁珠的 CD4 抗体；

（5）CD4-FITC 或 KJ1 - 26-PE；

（6）7-AAD；

（7）预冷 PBS，含 2 mmol/L EDTA 和 1% 胎牛血清；

（8）完全 RPMI 1640 培养基；

（9）红细胞裂解液 0.02 mol/L Tris-HCl（pH7.2）；0.14 mol/L NH₄C_l。

仪器：

磁性分离装置、3 μm 荧光标记的珠子（可选）、96 孔圆底板、流式细胞仪。

树突状细胞的抗原提呈功能检测的基本过程可分为以下几步：

（1）常规取 DO11.10 小鼠脾脏制备脾脏细胞悬液，用 NH，C1 溶液裂解红细胞，再用预冷 PBS 洗涤细胞，调整浓度为 2 x 10⁸ 个/ml。

（2）加入包被磁珠的 CD4 抗体，4 ℃ 孵育 20 分钟后，离心洗涤，用预冷 PBS 调节细胞浓度至 2 x 10 个/ml，用磁性分离装置分离磁珠包被的细胞。

（3）洗脱阳性细胞，用完全 RPMI 1640 培养基调整细胞浓度为 1 x 10⁶ 个/ml 后，加入 OVA 17 肽至终浓度为 200～400 nmol/L。

（4）按 100 μl/孔接种 96 孔圆底培养板。设立 T 细胞空白对照组，每组设立 3 个复孔。

（5）取与 T 细胞相同背景的小鼠 DC 细胞，用完全 RPMI 1640 培养基离心洗涤后，用完全 RPMI1640 培养基调整浓度，使 DC 与 T 细胞的浓度之比分别为 1:5、1:10、1:20。

（6）将不同浓度的 DC 按 100 μl/孔加入已经接种了 T 细胞的 96 孔圆底板中。设立 DC 空白对照组。T 细胞和 DC 的空白对照组加入等量完全 RPMI1640 培养基。将培养板放入细胞培养箱中培养。

（7）培养 3～4 天后终止。小心收集含有 T 细胞的上清 150 μl/孔，然后加入含有 CD4-FITC 或 KJ1-26-PE 和 7-AAD 的标记液，10 μl/孔，4 ℃ 孵育 15 分钟后，加入 PBS 至 200 μl，移至流式上样管。

（8）FACS 高速上样。分析结果时，以 7-AAD 阴性、CD4 或 KJ1-26 阳性的细胞作为活细胞，计算活细胞相对数。

（9）细胞培养上清可以用来检测 IL-2 和 IFN-γ 的浓度，反映 T 细胞的活化及增殖情况。