树突状细胞的一氧化氮分泌能力检测

树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前公认的体内功能最强大的专职抗原提呈细胞（professional antigen presenting cell，APC）， 在免疫应答的首要环节--抗原提呈过程中扮演着重要的角色，是唯一能够活化初始 Th 细胞的 APC，成为适应性免疫应答的始动者；同时，DC 也在诱导机体的免疫耐受中发挥重要作用。在免疫稳定状态下，分布于外周非淋巴组织的 DC 处于非成熟状态，主要功能为识别和摄取抗原。

与其功能相适应，非成熟 DC 表面表达低水平的 MHC II 类分子和共刺激分子，高表达一系列受体以便于识别与病原体相关的物质，包括多种 Toll 样受体（Toll like receptor，TLR），C 型凝集素如甘露糖受体、DEC205 等。一旦发生感染或组织损伤，非成熟 DC 就会向炎性部位迁移，摄取加工抗原，并释放大量的炎性因子，激发天然免疫应答，避免感染的扩散。

相应地，非成熟 DC 发生了一系列的变化，获得了成熟表型及功能：

① 丢失用于吞噬的受体；

② 高表达 MHC II 类分子和共刺激分子，包括 CD40、CD80 和 CD86；

③ 形态发生改变；

④ 启动抗原处理机制，包括溶酶体相关的膜蛋白（DC-LAMP）的水平增加。同时，成熟 DC 的趋化因子受体表达谱发生变化，CCR1、CCR5 和 CCR6 等的表达降低，而 CCR7 的表达会增高，从而促使 DC 从外周组织沿传入淋巴管迁移至邻近的次级淋巴组织，与初始 T 细胞相遇，诱导其活化并增殖成为抗原特异性的效应 T 细胞，从而启动免疫应答。因此，DC 在非成熟期和成熟期的表型和功能各不相同。

树突状细胞的一氧化氮分泌能力检测的基本原理是某些 DC 亚群受到特定刺激后会产生一氧化氮（nitric oxide，NO）发挥负向免疫调节作用。NO 由一氧化氮合成酶（nitric oxide synthases，NOS）催化 L-精氨酸与氧分子经多步氧化还原反应而生成。NOS 目前已知有 3 种异构体，分别为神经元型（neuronal NOS，nNOS）、内皮型（endothelial NOS， eNOS）及诱导型（inducible NOS，iNOS）。

前两者为固有表达的酶，依赖于钙离子，正常状态下存在于神经组织及内皮细胞等细胞上。而 iNOS 的激活不依赖于钙离子，可被多种刺激因素如外来抗原、细胞因子或细菌内毒素所诱导。体内高出生理浓度的 NO 一般是 iNOS 被活化的结果。由于 NO 极不稳定，在水溶液中很快被氧化成 NO2 和 NO3，所以一般用测定 NOz/NO3 的浓度的方法反映 NO 的活性。通常用已知浓度的 NaNO2 溶液作为标准品计算浓度。

Griess 法测定 NOz/NO；含量简便易行，是目前使用最普遍的方法。但该法灵敏度不高，一般为 10-7～10- 8 mol/L 水平。采用高效液相色谱法测定 NOz/NO5，可提高灵敏度，并能同时将 NO2 和 NO3 区分开来测定。另外，因灵敏度低，样品不宜做高倍稀释，故所需的样品量较大。

试剂：

（1）树突状细胞培养上清。

（2）2 mmol/L N_aNO₂，4 ℃ 保存。

（3）Griess 试剂。

仪器：

96孔平底细胞培养板

树突状细胞的一氧化氮分泌能力检测的基本过程可分为以下几步：

（1）根据实验需要将 DC 不同处理后培养 24～72 小时，取各组上清 100 μl 分别加入 96 孔平底板中。

（2）将 N_aNO₂ 溶液倍比稀释（终浓度从 125 μmol/L 至 1 μmol/L）后，各取 100 μl 加入 96 孔平底板中。

（3）在待测孔和 N_aNO₂ 标准孔中加 100μl Griess 试剂。先加入氨基苯磺酰胺（sulfanilamide），然后再加入萘乙二胺（naphthylenediamine）。

（4）用酶联仪检测 N_aNO₂ 标准孔和各待测孔的光吸收值，测量波长为 500 nm。用 N_aNO₂ 标准孔的光吸收值和对应的浓度做一标准曲线（在 0～125 μmol/L 范围内应呈线性相关）。用此标准曲线计算出各待测样品 NO2 值。结果以 NO2 浓度值（μmol/L）或标准化换算后的 NO2 摩尔值表示，即 10 个细胞或 1 mg 蛋白质样品的 NO2 摩尔数（nmol/10 个细胞或 nmol/mg 蛋白质）。

（1）本方法检测 NO2 灵敏度为 1 μmol/L 左右。

（2）测定细胞培养介质中的 NOz/NO3 时，培养液成分中应不含酚红，因为酚红在酸性环境中呈现的红色会干扰比色测定。培养液中污染的少量 NOz/NO3 可通过平行测定扣除背景。