树突状细胞（DC）
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树突状细胞（DC）
树突状细胞作为一种重要的抗原提呈细胞，参与免疫应答的启动和调节。它具有一些不同于其他细胞的特性如粘附性（过夜培养后，便失去粘附性）、比重较低等。人外周血中DC含量很少，仅占单个核细胞的0.1%～1%。
利用细胞粘附和密度梯度离心的方法虽然可分离纯化外周血树突状细胞，但此法分离的DC，不仅纯度低，数量少，而且处于不同的分化阶段，已难以满足临床研究的需要。随着人们对DC发生学的认识不断深入，许多学者开始用多种细胞因子诱导不同的前体细胞沿着不同的分化途径在体外扩增DC。
（一）人外周血树突状细胞的分离
【试剂及配制】
（1） 分离外周血单个核细胞所需试剂
（2） 做E花环实验所需试剂
（3） 无Ca2+ 、Mg2+ Hank’s液
（4） 10% FCS的RPMI-1640培养液
（5） 抗人IgG抗体
（6） Percoll应用液：将9份Percoll原液加1份2mol/L PBS配制成等渗Percoll应用液。取此等渗Percoll应用液14.7ml和13.3mlFCS，于50ml离心管中混合均匀，4℃，1000r/min离心25min，置4℃冰箱保存备用。
【操作方法】
（1） 取肝素抗凝血用聚蔗糖-泛影葡胺分层液分离单个核细胞，用无Ca2+ 、Mg2+ Hank’s液洗2-3次，用10% FCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×106 /ml；
（2） 将外周血单个核细胞悬液置37℃，5% CO2 温箱孵育3h，去掉上层悬浮细胞，加适量含10% FCS的RPMI-1640培养液，继续培养过夜（或12-18h）；
（3） 轻轻吹起并收集未粘附的细胞，与2%-5% SRBC混匀，使T细胞与SRBC结合形成E-花环，再通过Percoll 3000r/min离心20min，收集次低密度层细胞
（4） 用无Ca2+ 、Mg2+ Hank’s液洗细胞，再用10% FCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至107 /ml，并将细胞悬液加至预先包被有抗人IgG的24孔培养板中，37℃ 1h进行亲和吸附(Panning),Panning可反复进行多次。用10% FCS的RPMI-1640培养液收集悬浮细胞，此为富含DC的细胞。
（二）人外周血单核细胞诱导DC
【试剂及配制】
（1） 分离外周血单个核细胞所需试剂
（2） 10%FCS的RPMI-1640培养液
（3） IL-4与GM-CSF
【操作方法】
（1） 取肝素抗凝静脉血50ml, 按常规方法分离单个核细胞，并通过贴壁获得单核细胞（具体方法见相关章节）；
（2） 用10% FCS的RPMI-1640培养液悬浮细胞,调细胞浓度106 /ml；
（3） 将单核细胞悬液加入24孔培养板中，1ml/孔，并加入IL-4（50 ng）与GM-CSF（100 ng），置37℃ ，5% CO2 培养箱中培养，3天后用含有IL-4与GM-CSF及10%FCS的RPMI-1640培养液半量换液；
（4） 培养7天后，显微镜下观察，可见原始贴壁细胞悬浮或成团，并表现出树突状细胞的形态特征；
（5） 吸取悬浮细胞，并用RPMI-1640培养液洗涤1次，重悬于RPMI-1640培养液中备用。
【注意事项】
（1） 行半量换液时，注意不要将细胞吸出。
（2） DC细胞尚无特异性标记，上述分离细胞表面标记应为CD3（-）、CD4（-）、CD8（-）、CD19（-）、CD21（-）、CD16（-）、CD14（-）和MHC-II（+），可以用FCM或免疫荧光法分析鉴定。
