分离纯化RNA的简单实验步骤及常见失败的原因

相关专题

本文介绍了从组织或细胞中分离纯化RNA的简单实验步骤，并列举了一些提取RNA过程中常见失败的原因供大家参考。

实验步骤：

1. 取50~100mg的组织,加入1 ml Trizol试剂，用匀浆器打匀(Trizol 先放于冰上)。

2. 将匀浆室温放置5 min。

3. 加入200 μl 氯仿,剧烈震荡混匀30s，冰上静置3min。

4. 12000 rpm，4℃ 离心15 min。

5. 将上清液小心转移到新的1.5 ml离心管中(取400μl )，加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15 min。(此步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。)

6. 12000 rpm， 4℃ 离心15 min 。

7. 小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。

8. 用70%乙醇(DEPC处理的水配制)洗涤1次，加入700 μl乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。(此时RNA是不溶解的)

9. 8000 rpm，室温离心10min。

10. 尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。

11. 真空离心干燥3~5分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。

12. 沉淀用30 μl DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68 ℃处理10 min。

13. RNA检测

(1)测定样品在260 nm和280 nm的吸光值按1OD=40 μg/ ml RNA计算RNA的产量。OD260/OD280在1.8-2.0 。

(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定RNA的完整性和污染情况。

常见失败原因：

1、低得率

A.样品裂解或匀浆处理不彻底

B.最后得到的RNA沉淀未完全溶解

2、A260/A280<1.65

A.检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而

是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280

值会较高。

B.样品匀浆时加的试剂量太少。

C.匀浆后样品未在室温放置5分钟。

D.水相中混有有机相。

E.最后得到的RNA沉淀未完全溶解。

3、RNA降解

A.组织取出后没有马上处理或冷冻

B.样品或提取的RNA沉淀保存于-5--20℃，

未在-60--70℃保存。

C.细胞在胰酶处理时被破坏。

D.溶液或离心管未经RNase去除处理。